BIAŁKA FUZYJNE
Produkcja:
Synteza chemiczna - małe cząst. Białkowe i peptydy,
Techniki biologii molekularnej, inż. genet., duże i modyfikowane białka - b. rekombinowane
K. bioreaktory E.coli, Saccharomyces:
Niska wydajność- niska ekspresja genu; obecność enzymów wewnątrz kom.; trudność w izolacji/ oczyszczaniu syntetyzowanych białek,
Dołączenie syntetyzowanego białka do innego stabilnego białka:
Zapobieganie degradacji zewnętrz.bioreaktorów,
Zapewniają wysoką ekspresję,
Ułatwia oczyszczanie.
Białka fuzyjne:
Fuzje białek prowadzi się na poziomie DNA
Sekwencja kodująca stabilne białko kom. łączy się z sekwencją kodującą białka, które ma być syntetyzowane,
Po przeprowadzeniu transkrypcji i translacji powstaje białko fuzyjne.
Połączenie musi respektować zasady kodu genet.: trójkowość, bezprzecinkowość, zgodność ramek odczytu.
Uwaga :
kodon „stop” gen. Kom. Musi być usunięty.
musi być zachowana ciągłość ramki odczytu białka fuzyjnego.
element fuzyjny może być usuwany przez trawienie enzymatyczne (endonukleoza, endopeptydaza).
Wektor do klonowania b. fuzyjnego:
omp F - promotor genu,
lac 2 - stabilne białko kom (umożliwia selekcję i izolację)
omp F - gen białka docelowego.
Podłoze selekcyjne z ampicyliną.
Oczyszczanie białek fuzyjnych:
białko kom. może przyłączyć się do wybranej cząstki np. przeciwciało (Pc)
cząsteczka Pc może być z kolei przytwierdzona do stałego nośnika
białko fuzyjne zostaje wychwycone na nośniku
kolejny etap elucja b. f. z kolumną.
Białkiem kom. może być:
MBP (białko wiążące maltozę)
GST (transferaza glutationowa)
Kolumny są wypełnione wówczas maltozą lub glutationem.
Po syntezie i oczyszczeniu konieczne jest usunięcie dołączonego białka kom:
Może zakłócać metabolizm kom.
Może przeszkadzać w zastosowaniach klinicznych.
Rozszczepienie białek fuzyjnych:
Pomiędzy białkiem docelowym a b. kom. musi znajdować się sekwencja rozpoznawana przez proteazę (odp endonuklezay restrykcyjnej)
Proteaza Pochodzenie
Cz. Xa czynnik krzepnięcia
Enterokinaza jelito bydła
TEV proteazę Tobacco Etch Virus
Rozpoznają i przecinają krótkie sekwencje aminokwasów 7aa 8aa
Przykł.
ENBREL - domena rec TNF α i rejon Fc immunoglobiny G1; choroba Crona i RZS.
ONTAK - Il-2 + toksyna błonnicza - leczenie chłoniaka skóy.
Przeciwciała monoklonalne:
Odporność to zdolność do czynnej i biernej ochrony organizmu przed patogenami
Ze względu na mechanizm wyróżniamy odp. humoralną (Pc) i odp. komórkową (limf. T)
Ze względu na swoistość:
Nieswoista :
Bierna (skóra, błony śluzowe),
Czynna (kaszel, kichanie)
swoista: bierna, czynna i kom. (limf. B, C i Pc)
ze względu na szybkość i długość reakcji : wtórna i pierwotna.
Przeciwciała:
są wydzielane do krążenia i wydzielnin surowiczo- śluzowych (mleko, ślina, płyn mózgowo-rdzeniowy, owodniowy) przez plazmocyty (powstałe z limf. B),
cząsteczka Pc jest swoista wobec
Region Fab - powinowactwo (siła wiązania A g i Pc, swoistość)
Region Fc - warunkuje funkcje efektorowe, T0.5 umożliwia przejście Ig przez łożysko.
X 2 łańcuchy ciężkie i lekkie.
Przeciwciała poliklonalne:
wytwarzane przez liczne klony limf. B
skierowane wobec całego zestawu epitopów na Ag
zwiększona skuteczność w warunkach nat.
Zmniejszenie przydatności do celów naukowych.
Przeciwciała monoklonalne:
Powstają z jednego klonu limf. B
Specyficzne względem jednego epitopu
Wykorzystywane w diagnostyce terapii i badaniach naukowych.
Epitop:
Przeciwciało rozpoznaje tylko niewielka część antygenu
Fragment, który jest rozpoznawany nazywa sie epitopem
Jeden antygen może posiadać wiele epitopów.
Produkcja:
Antygen, przeciwko któremu projektowane jest przeciwciało, jest oczyszczany i wstrzykiwany do organizmu myszy. A g mają być całe kom błony kom. wirusy.
W celu wzmocnienia odp. immunologicznej z Ag wprowadza się adiuwant - wydłuża czas ekspozycji Ag, np. adiuwant Freunda.
W organizmie myszy namnażają się limfocyty B, które wytwarzają przeciwciała przeciwko wstrzykniętemu antygenowi.
Mysz immunizuje się tak długo aż uzyskamy odp. wysokie stężenie Pc w surowicy.
Limf. B ( w tym te, które produkują Pc ) są izolowane ze śledziony.
Limf. B wytwarzające Pc ulegają fuzji z kom szpiczaka myszy dając hybrydomy.
m. fizyczna - ultradźwięki,
m. chemiczna - z użyciem glikolu polietylenowego,
m. biologiczna - z użyciem wirusa Senday.
Namnażanie hybryd w org. myszy (infekcja podskórna lub dootrzewnowa).
Selekcja hybrydu:
Fuzja:
Limf-limf
Kom szpiczaka-kom. szpiczaka
Limf-kom szpiczaka
Pożwyka selekcyjna HAT - hipoksantyna, tymidyna.
Amidopteryna- antagonista kw. foliowego blokuje syntezę puryn i pirymidyn; synteza de novo zablokowana.
Szlak ratunkowy: kom. syntetyzuje DNA wykorzystyjąc zasady azotowe zawarte w pożywce.
Przekształcając tymidyne w tymine i hipoksantyne w guanine.
Na pożywce HAT rosną limf. lecz liczba ich podziałów jest ograniczona do ok. 20.
Kom. szpiczaka mają defekt genet. i metaboliczny - są mutantami niezdolnymi do produkcji enzymów HCPRT, TK ( kinaza tymidylanowa).
Kom. szpiczaka na pożywce HAT nie rosną
Limf. B z HCPRT giną po kilku pasażach - limit podziałów
Przeżywają tylko hybrydony - wytwarzające Pc.
Zastosowanie:
W medycynie klinicznej jako narzędzie w diagnostyce ( w tym obrazowej), terapii,
Znakowanie Pc do detekcji i lokalizacji antygenów badanych próbek, np. western blot, immunizacja w skrawkach,
Znakowanie radioaktywne Pc
Western bloting.
Preparaty enzymatyczne:
RENINA:
Ścinanie kazeiyn w mleku
Mucor rouxini
Produkcja serów
INWERTAZA:
Hydroliza cukrów
Aspergillus oryzae, drożdże
Produkcja cukru do wyrobu słodyczy
PROTEAZY:
Hydroliza białek
B. subtilis
Dodatek do detergentów
Garbowanie skór
LIPAZA:
Hydroliza lipidów
Pseudomonas, grzyby
Dodatek do detergentów
Garbowanie skóry
AMYLAZA:
Hydroliza skrobi
B. subtilis, Aspergillus
Produkcja syropu glukozowego
PULLULANAZA:
Hydroliza skrobii
Bacillus
Rozcinanie wiązań α 1-4 i α 1-6
CELULAZY:
Hydroliza celulozy
Trichoderma viride, Penicylinum
Produkcja glukozy z celulozy