Enzymy restrykcyjne

Pod względem typu nacięć endonukleazy restrykcyjne wykazują dużą różnorodność. Przecięcie nici DNA może generować powstawanie: (a) lepkich końców 5', (b) lepkich końców 3' lub (c) tzw. tępych końców:

(a) EcoRI 5' G^¯AATTC 3'

3' CTTAA_­G 5'

(b) PstI 5' CTGCA^¯G 3'

3' G_­ACGTC 5'

(c)SmaI 5' CCC^¯GGG 3'

3' GGG_­CCC 5'

W wyniku zastosowania nieodpowiednich warunków reakcji może pojawić się niespecyficzna aktywność enzymu - tzw. "star activity". Czynniki powodujące star acitivity to:

• zbyt wysokie stężenie enzymu w mieszaninie reakcyjnej

• nieoptymalne pH;

• obecność w mieszaninie reakcyjnej jonów Mn²⁺, zamiast Mg²⁺ (jony Mg²⁺ są niezbędne dla aktywności nukleaz);

• zbyt niskie stężenie soli (w buforze powinien być zawarty 10mM Tris-HCl, który stanowi czynnik buforujący, często wymagana jest też obecność KCl);

• obecność rozpuszczalników organicznych;

• zbyt wysokie stężenie glicerolu (enzymy przechowuje się w temp -20 ^oC w glicerolu, jednak aby enzym działał prawidłowo końcowe stężenie glicerolu nie powinno przekraczać 5 %);

• zbyt wysoka temperatura.

Brak działania enzymu może być wywołany m.in.: (i) metylacją DNA lub (ii) jego inaktywacją termiczną.

Inaktywacja enzymów restrykcyjnych po reakcji enzymatycznej:

• inaktywacja termiczna (zwykle w temperaturze powyżej 65 ^oC);

• denaturacja białek poprzez dodanie mieszaniny fenol:chloroform:Tris (po odbiałczeniu preparatu należy podda go precypitacji);

• dodanie EDTA do stężenia końcowego 12,5 mM (następuje wymiareczkowanie jonów Mg²⁺).

Zgodnie z regulaminem serwisu www.bryk.pl prawa autorskie do niniejszego materiału posiada Wydawnictwo GREG. W związku z tym, rozpowszechnianie niniejszego materiału w wersji oryginalnej albo w postaci opracowania, utrwalanie lub kopiowanie materiału w celu rozpowszechnienia w szczególności zamieszczanie na innym serwerze, przekazywanie drogą elektroniczną i wykorzystywanie materiału w inny sposób niż dla celów własnej edukacji bez zgody Wydawnictwa GREG podlega grzywnie, karze ograniczenia wolności lub pozbawienia wolności.

---