Techniki przygotowania i barwienia preparatów mikroskopowych.
Techniki mikroskopowania.
Struktury anatomiczne istotne w identyfikacji i diagnostyce drobnoustrojów.
Ocena morfologii drobnoustrojów.

TECHNIKA BARWIENIA

Bakterie prawie nie załamują światła, w związku z tym, aby je uwidocznić, należy użyć barwnych związków chemicznych. Barwienie jest procesem drastycznym, w trakcie którego następuje śmierć komórki. W większości metod, komórki barwią się jednolicie.
Stosowane barwniki możemy podzielić na:

1. Kwaśne - eozyna, fuksyna kwaśna

2. Zasadowe - błękit metylenowy, fuksyna zasadowa, czerwień obojętna, fiolet krystaliczny.
   

Barwienie ma na celu:
a) umożliwić obejrzenie układu przestrzennego morfologii i anatomii komórek
b) wykazać obecność bakterii w badanym preparacie

Przygotowanie preparatu z hodowli:
1.  Przygotowanie rozmazu na szkiełku podstawowym - pobrać jedną kolonię ezą i rozetrzeć na szkiełku.
2. Połączyć z kroplą 0,9% NaCl
3. Pozostawić do wyschnięcia
4. Utrwalić w płomieniu palnika

Metody barwienia:

• Proste (jeden barwnik):

• Pozytywne (barwią się komórki bakteryjne)

• Negatywne (barwi się tło)

• Złożone (kilka barwników):

• Pozytywne (j. w. )

• Pozytywno - negatywne (barwią się elementy komórek bakteryjnych i tło - metoda uwidaczniania otoczek)

Ocena morfologii komórki:

a) wynik barwienia

b) wielkość

c) układ
d) kształt komórki bakteryjnej

e) obecność i ułożenie rzęsek

f) obecność otoczki
g) obecność ciał zapasowych
h) obecność, kształt, wielkość, ułożenie przetrwalników

Typ barwienia	Metoda	Metodyka	Wynik
Proste - pozytywne	Metoda Löfflera	Błękit metylenowy - 5 min Spłukać wodą	Jednolite niebieskie, (wyjątek Corynebacterium - zabarwione nierównomiernie)
Proste - pozytywne	Barwienie safraniną	Safranina - 5 minut	Jednolite czerwone zabarwienie
Proste - negatywne	Barwienie nigrozyną lub tuszem chińskim	Na brzegu szkiełka podstawowego zmieszać kolonię bakteryjną z kroplą barwnika, drugim szkiełkiem wykonać rozmaz	Tło ciemne, niezabarwione drobnoustroje (otoczki)
Złożone pozytywno - negatywne	Barwienie otoczek wg Burri - Ginsa	Nigrozyna + fuksyna fenolowa Ziehla Na brzegu szkiełka podstawowego zmieszać kolonię bakteryjną z kroplą nigarozyny, drugim szkiełkiem wykonać rozmaz. Dobarwić fuksyną fenolową - 1-2 min	Ciemne tło, jasne otoczki, czerwone komórki bakteryjne
Złożone pozytywno - negatywne	Barwienie przetrwalników wg Dornera	Na brzegu szkiełka podstawowego zmieszać kolonię bakteryjną z kroplą nigarozyny, drugim szkiełkiem wykonać rozmaz. Dobarwić safraniną na gorąco.	Ciemne tło, czerwone przetrwalniki
Złożone - pozytywne	Metoda Grama	Fiolet krystaliczny - 2-3 min Spłukać wodą Płyn Lugola - 1-2 min Spłukać wodą Odbarwiacz Spłukać wodą Fuksyna zasadowa - 0,5 min Spłukać wodą	Gram dodatnie - fioletowe Gram ujemne - czerwone   Gram chwiejne - czerwono- fioletowe (np. Corynebacterium)
Złożone - pozytywne	Metoda Neissera Wybarwianie ziaren metachromatycznych (Babesa-Ernst'a) u Corynebacterium	Neisser I (roztwór błękitu metylenowego) Neisser II (roztwór fioletu krystalicznego). Zmieszać odczynniki w stosunku 2:1, barwić 10 min. Chryzoidyna 10 - 15 s	Komórki bakterii - żółto - zielone, ziarna metachromatyczne - granatowe.
Złożone - pozytywne	Metoda Waysona Do barwienia preparatów bezpośrednich	Barwnik Waysona - 2 min (fiolet krystaliczny + błękit metylenowy)	Komórki bakterii ciemnogranatowe, inne np. nabłonki, leukocyty jasnofioletowo - granatowe
Złożone - pozytywne	Metoda Wirtza-Conklina do barwienia przetrwalników	Safranina - 5 min Spłukać wodą Zieleń malachitowa na gorąco Spłukać wodą	Komórki bakterii czerwone, Przetrwalniki zielone
Złożone - pozytywne	Metody barwienia bakterii kwasoopornych: Ziehl - Neelsena	Fuksyna karbolowa na gorąco Spłukać wodą Spłukać kwaśnym alkoholem	Bakterie kwasooporne - czerwone Tło i pozostałe bakterie - niebieskie
Złożone - pozytywne	Metody barwienia bakterii kwasoopornych Kinyoun - Gabett'a	Błękit metylenowy 20 min	Efekt barwienia j.w.
Złożone - pozytywne	Metody barwienia bakterii kwasoopornych: Kinyoun	Barwnik Kinyoun - 3 min Barwnik Gabett'a Spłukać wodą Fuksyna karbolowa - 5 min Spłukać wodą Kwaśny alkohol- 3 min Spłukać wodą Zieleń brylantowa 4 min Spłukać wodą	Bakterie kwasooporne czerwone Tło i pozostałe bakterie - zielone

BUDOWA KOMÓRKI BAKTERYJNEJ

1. struktury podstawowe
   · ściana komórkowa
   · błona cytoplazmatyczna
   · cytoplazma
   · rybosomy
   · nukleoid
   

2. struktury dodatkowe
   · otoczki
   · rzęski
   · fimbrie
   · przetrwalniki
   · wtręty komórkowe
   · plazmidy

ŚCIANA KOMÓRKOWA

Zbudowana jest z peptydoglikanu (mureiny). Cząsteczka peptydoglikanu jest zbudowana z długich łańcuchów polisacharydowych, które łączą się w sieć za pomocą mostków peptydowych.

Każdy łańcuch polisacharydowy zbudowany jest z dwuckrów:

→ N-acetyloglukozaminy

→ Kwasu N-acetylomuraminowego (występuje wyłącznie u organizmów prokariotycznych).

Do kwasu N-acetylomuraminowego dołączony jest tetrapeptyd Często w jego składzie spotyka się aminokwasy występujące jedynie u bakterii ( np. kwas mezodwu-aminopimelinowy, izomery D alaniny i kwasu gluta-minowego).

Wiązania krzyżowe peptydoglikanu powstają przez połączenie tetrapeptydów sąsiadujących łańcuchów mostkiem peptydowym

Wiązanie powstaje pomiędzy przedostatnią resztą jednego tetrapeptydu (przeważnie L-lizyna lub kwas mezodwuaminopimelinowy) a ostatnią resztą drugiego tetrapeptydu (zwykle D-alanina)

Mostki zbudowane są przeważnie z glicyny lub L -alaniny.

Ze względu na różnice w budowie ściany komórkowej dzielimy bakterie na Gram - dodatnie i Gram - ujemne.

Ściana komórkowa bakterii Gram - dodatnich

• Grubość: 20 - 80 nm

• Składa się w 60-100% z peptydoglikanu tworzącego trójwymiarową sieć. Złożony z linijnych polimerów N-acetyloglukozaminy i kw. N-acetylomuraminowego.

• Peptydoglikan bakterii Gram - dodatnich może być hydrolizowany przez lizozym. Hydrolizowane jest wiązanie pomiędzy kw. N-acetylomuraminowym a N-acetyloglukozaminą.

• U niektórych bakterii przy aminocukrach występują dodatkowe grupy O-acetylowych, które czynią peptydoglikan niewrażliwym na działanie lizozymu.

• Charakterystycznymi składnikami ścian komórkowych bakterii Gram - dodatnich są także kwasy tejchojowe (rybitolowy i glicerolowy) ich obecność ma znaczenie taksonomiczne.

• U niektórych bakterii Gram - dodatnich mogą występować w ścianach komórkowych polisacharydy i kwasy mykolowe

• Białka ściany komórkowej np. białko M u Streptococcus pyogenes gr. A mogą być antygenami i warunkować właściwości chorobotwórcze bakterii.

Ściana komórkowa bakterii Gram - ujemnych

• Grubość: 10 nm

• Bardziej złożona budowa chemiczna i strukturalna

• Składa się z czterech warstw:
  1. Lipopolisacharyd

• 2. fosfolipidy

3. białka

4. peptydoglikan

• Lipopolisacharyd (LPS), endotoksyna:

• Heteropolimer zbudowany z trzech składowych

• Lipid A

• Oligocukier rdzeniowy - podobny u wszystkich bakterii Gram - ujemnych, często nazywany antygenem wspólnym (CA - common antigen) lub antygenem Kunina

• Antygen somatyczny (antygen O): leży najbardziej zewnętrznie, składa się z podjednostek oligocukrowych

• Jest odpowiedzialny za wiele objawów chorobowych u ludzi i zwierząt; najpoważniejszym z nich jest wstrząs endotoksyczny

• Fosfolipidy - podobne do fosfolipidów błony komórkowej, tworzą dwie warstwy skierowane do siebie regionami hydrofobowymi.

• Białka główne - wiążą się między sobą, z LPS i peptydoglikanem, tworzą kanały porynowe

• Peptydoglikan: cieńszy, struktura dwuwymiarowa, bardziej elastyczny, nie występują mostki peptydowe tworzące wiązania krzyżowe, wiąże się z błoną cytoplazmatyczną wiązaniami jonowymi.

BŁONA CYTOPLAZMATYCZNA

• Wykazuje typową dla wszystkich błon elementarnych strukturę trójwarstwową i zbudowana jest z lipidów (20-35%) i białek (50-75%).

NUKLEOID

• Obszar komórki prokariotycznej będący odpowiednikiem jądra komórkowego u Eukaryota.

• Nie jest oddzielony od cytoplazmy otoczką jądrową.

• Zawiera genofor (chromosom bakteryjny), czyli pojedynczą, kolistą cząsteczkę dwuniciowego DNA.

• Niektóre funkcje organizmu (np. oporność na antybiotyki, synteza bakteriocyn) są kodowane przez plazmidy - samoreplikujące się, zamknięte, koliste cząsteczki dwuniciowego DNA.

• Nukleoid wraz z plazmidami zawiera pełną informację genetyczną komórki.

CYTOPLAZMA

• Wodny roztwór związków wielkocząsteczkowych, soli mineralnych, cukrów prostych, aminokwasów, kwasów tłuszczowych i związków wysokoenergetycznych o charakterze koloidu, w którym zawieszone są biologicznie czynne struktury: nukleoid, plazmidy, rybosomy, materiał zapasowy (ziarnistości, wtręty, kryształki, kropelki).

RYBOSOMY

• Rybosomy u Prokaryota są mniejsze niż u Eukaryota, mają niższą masę cząsteczkową i stałą sedymentacji Svedberga, wynoszącą 70S.

ZMIENNE ELEMENTY KOMÓRKI BAKTERYJNEJ

OTOCZKI

• Chronią bakterie przed wyschnięciem, ułatwiają adhezję, chronią przed reakcją obronną zakażanego organizmu, mogą być czynnikiem zjadliwości.

• Można je uwidocznić pod mikroskopem świetlnym stosując barwniki nie przechodzące przez materiał otoczkowy, np. nigrozynę, czerwień Kongo, tusz chiński. W technice barwienia negatywnego na ciemnym tle preparatu pojawiają się jasne otoczki.

RZĘSKI

• Rzęski są to wyrostki o średnicy 12-18 nm i długości do 20 μm.

• Za pomocą ciałka bazalnego są zaczepione jednym końcem w błonie cytoplazmatycznej.

• Umiejscowienie i liczba rzęsek jest dla bakterii cechą charakterystyczną i ma znaczenie taksonomiczne.

• Obecność i ułożenie rzęsek na komórce:

• ditrychalne (dwurzęse)

• monotrychalne (jednorzęse)

• lophotrychalne (czuborzęse)

• jednobiegunowe

• dwubiegunowe

• perytrychalne (wkołorzęse)

FIMBRIE / PILE

• Niektóre bakterie gram-ujemne mogą wytwarzać nitkowate, zakotwiczone w cytoplazmie wyrostki - fimbrie.

• Są to długie, cienkie, proste nici o średnicy 3-25 nm, długości do 12 μm.

• Grubsze wyrostki, zwane też pilami płciowymi (pilami typu F), służą podczas koniugacji do przenoszenia DNA.

PRZETRWALNIKI (ENDOSPORY)

• Niektóre gatunki bakterii mają zdolność wytwarzania przetrwalników (rodzaje: Bacillus, Clostridium)

• W razie występowania niekorzystnych warunków środowiska rozpoczyna się proces sporulacji, w którym następuje zagęszczenie protoplazmy, ustają procesy metaboliczne, zawartość przetrwalnika jest otaczana grubą ścianą.

• Przetrwalniki są bardzo odporne na działanie niekorzystnych czynników fizycznych i chemicznych

• Po zaistnieniu korzystnych warunków środowiskowych rozpoczyna się kiełkowanie (germinacja) przetrwalników.

• Ułożenie przetrwalników:

• Centralne

• Paracentralne

• Subterminalne

• Termialne

5

---