Ćwiczenie 5

Wykazanie aktywności peroksydazowej w materiale biologicznym.

Materiały:

Biokatalizatory: korzeń pietruszki, liście fasoli, ziemniak, igły sosny, bufor octanowy 0,05M (pH 5,6), 0,02 M roztwór pirogalolu, 0,06 roztwór H₂O₂

Wykonanie:

1. 1 g materiału roślinnego zhomogenizować w moździerzu z 1-3 ml buforu octanowego i uzupełnić buforem do 10ml. Przenieść do sterylnej kolbki okrąglodennej.

2. Kolby wytrząsać przez 10 min, następnie odwirować 5ml zawiesiny.

3. Zlać supernatant do probówki (zostawić). Osad w probówce wirówkowej zalać ponownie 5 ml buforu, rozmieszać i odwirować.

4. Połączyć supernatanty.

5. Przygotować próby:

a. do szklanej probówki wprowadzić 0,9ml buforu octanowego, 0,5 ml r-ru pirogalolu, 500μl ekstraktu enzymatycznego, 0,5 ml H₂O_2.

b. do szklanej probówki wprowadzić 0,9ml buforu octanowego, 0,5 ml r-ru pirogalolu, 500μl ekstraktu enzymatycznego, 0,5 ml H₂O_dest

c. do szklanej probówki wprowadzić 0,9ml buforu octanowego, 0,5 ml r-ru pirogalolu, 500μl H₂O_dest , 0,5 ml H₂O₂

6. Wymieszać i próby inkubować przez 4 min w temp. 30⁰C

7. Dokładnie po 4 min zmierzyć absorbancję roztworów przy λ=430nm.

8. Miarą aktywności enzymu (peroksydazy) jest różnica absorbancji próby a i b w obecności peroksydaz

Utlenienie pirogalolu

C=A/a*b (C- stężenie produktu mM, A- absorbancja, a- grubość kuwety, b=2.47 1/Mm*cm - milimolowy współczynnik absorpcji)

Mikrobiologia przemysłowa

---