Ćwiczenie 8. Analiza sanitarna wody (skrócona) (część. 1-2)
Oznaczanie liczebności bakterii psychro- i mezofilnych (woda ze studni)
1. Wykonać rozcieńczenie wody ze studni 10-1, w tym celu pobrać sterylnie 1 ml wody ze studni i umieścić w probówce z 9 ml jałowej soli fizjologicznej - rozcieńczenie 10-1.
2. Wykonać posiew metodą płytek lanych na podłoże agarowe odżywcze (MPA), wprowadzając do czterech (2 na mezofile, 2 na psychrofile) sterylnych płytek Petriego po 1 ml wody ze studni z rozcieńczenia 10-1.
3. Do każdej z płytek dodać około 10 ml przestudzonego do 45°C agaru odżywczego (MPA) i pozostawić do zastygnięcia. Następnie płytki odwrócić.
4. Posiewy inkubować odpowiednio: mezofile w temperaturze 37°C przez 24 godziny (+/- 2 godziny) a psychrofile w temperaturze 20°C przez 72 godziny (+/- 2 godziny).
5. Po okresie inkubacji policzyć wyrosłe kolonie. Wynik oznaczenia (średnia z dwóch powtórzeń), podać jako liczbę bakterii mezofilnych oraz liczbę bakterii psychrofilnych w 1 ml wody (należy uwzględnić rozcieńczenie próby).
Analiza sanitarna wody ze studni
Badania wstępne
1. Wykonać system posiewów wody ze studni: 2x10; 2x1; 2x0,1 ml na podłoże Eijkmana. W tym celu pobrać sterylnie 10 ml wody ze studni i umieścić w probówce w z podłożem Eijkmana (2 powtórzenia), następnie należy pobrać 1 ml wody ze studni i umieścić w probówce z podłożem Eijkmana (2 powtórzenia) oraz kolejno pobrać 1 ml z rozcieńczenia wody ze studni 10-1 (z oznaczenia liczebności bakterii psychro- i mezofilnych) i umieścić w probówce z podłożem Eijkmana (2 powtórzenia).
2. Próby inkubować w temperaturze 37°C przez 24-48 godzin.
3. Po okresie inkubacji odczytać wynik. Za wynik dodatni (+) uznaje się zmianę barwy podłoża z zielonego (podłoże Eijkmana) na żółtą, pojawienie się gazu w rurkach Durhama oraz zmętnienie pożywki. Zmiany takie świadczą o wzroście w pożywce bakterii fermentujących laktozę z wytworzeniem kwasu i gazu. Brak gazu i zakwaszenia po 48 godzinach inkubacji przyjmuje się za wynik ujemny (-). Obecność niewielkich ilości gazu przy słabym zakwaszeniu lub jego braku przyjmuje się za wynik wątpliwy.
4. Odczytać wartość NPL i miano z tablic.
Badania potwierdzające
5. Z prób dodatnich (wybrać 2) na podłożu Eijkmana, przy użyciu ezy mikrobiologicznej wykonać posiew systemem powierzchniowym sektorowym (metodą izolacji czystych kultur) na płytki z podłożem Endo.
6. Posiewy inkubować w temperaturze 37°C przez 24 godziny.
7. Odczytać wynik. Za wynik dodatni, potwierdzający obecność bakterii grupy coli, przyjmuje się wzrost kolonii gładkich, ciemnoczerwonych, z charakterystycznym metalicznym połyskiem. Obecność nawet jednej typowej kolonii upoważnia do uznania hodowli za dodatnią.
8. Zawiesinę bakteryjną z dodatnich hodowli w próbkach z podłożem Eijkmana (wybrać 2) przenieść ezą mikrobiologiczną do probówek z pożywką z zielenią brylantową. Hodowlę, z której pobiera się materiał, należy przed posiewem wymieszać, lekko wstrząsając.
9. Posiewy inkubować w temperaturze 44°C.
10. Odczyt wykonać po 18-24 godzinach (niektóre szczepy E. coli dają wynik pozytywny już po upływie 6-8 godzin inkubacji). O wyniku dodatnim świadczy zmętnienie pożywki z równoczesną obecnością gazu w rurkach Durhama lub w całym podłożu, przy lekkim wstrząsaniu. W przypadku wyniku ujemnego po 24 godzinach hodowlę należy inkubować w ciągu następnych 24 godzin.
Oznaczenie liczebności bakterii psychro- i mezofilnych (woda z rzeki Kłodnicy)
1.Wykonać szereg rozcieńczeń wody z rzeki do 10-7. W tym celu pobrać sterylnie 1 ml wody rzecznej i umieścić w próbówce z 9 ml jałowej soli fizjologicznej (rozcieńczenie 10-1) procedurę powtarzać do uzyskania rozcieńczenia 10-7.
2. Wykonać posiew metodą płytek lanych na podłoże agarowe odżywcze (MPA), wprowadzając do dwóch sterylnych płytek Petriego po 1 ml wody ze studni z rozcieńczeń 10-3 i 10-4 (w celu oznaczenia liczebności bakterii mezofilnych) oraz do dwóch kolejnych płytek Petriego z rozcieńczeń 10-4 i 10-5 (w celu oznaczenia liczebności bakterii psychrofilnych).
3. Do każdej z płytek dodać około 10 ml przestudzonego do 45°C agaru odżywczego (MPA) i pozostawić do zastygnięcia. Następnie płytki odwrócić.
4. Posiewy inkubować odpowiednio: mezofile w temperaturze 37°C przez 24 godziny (+/- 2 godziny) a psychrofile w temperaturze 20°C przez 72 godziny (+/- 2 godziny).
5. Po okresie inkubacji policzyć wyrosłe kolonie. Wynik oznaczenia (średnia z dwóch powtórzeń), podać jako liczbę bakterii mezofilnych oraz liczbę bakterii psychrofilnych w 1 ml wody (należy uwzględnić rozcieńczenie próby).
Analiza sanitarna wody rzecznej (woda z Kłodnicy)
Badania wstępne
1. Wysiać po 1 ml zawiesiny z rozcieńczeń 10-1 - 10-7 do probówek z podłożem Eijkmana. Próby inkubować w temperaturze 37°C przez 24-48 godzin.
2. Po okresie inkubacji odczytać wynik. Za wynik dodatni (+) uznaje się zmianę barwy podłoża z zielonego (podłoże Eijkmana) na żółtą, pojawienie się gazu w rurkach Durhama oraz zmętnienie pożywki. Zmiany takie świadczą o wzroście w pożywce bakterii fermentujących laktozę z wytworzeniem kwasu i gazu. Brak gazu i zakwaszenia po 48 godzinach inkubacji przyjmuje się za wynik ujemny (-). Obecność niewielkich ilości gazu przy słabym zakwaszeniu lub jego braku przyjmuje się za wynik wątpliwy.
4. Odczytać miano, przeliczyć na NPL ze wzoru: NPL=100/miano
Badania potwierdzające
5. Z prób dodatnich (wybrać 2) na podłożu Eijkmana, przy użyciu ezy mikrobiologicznej wykonać posiew systemem powierzchniowym sektorowym (metodą izolacji czystych kultur) na płytki z podłożem Endo.
6. Posiewy inkubować w temperaturze 37°C przez 24 godziny.
7. Odczytać wynik. Za wynik dodatni, potwierdzający obecność bakterii grupy coli, przyjmuje się wzrost kolonii gładkich, ciemnoczerwonych, z charakterystycznym metalicznym połyskiem. Obecność nawet jednej typowej kolonii upoważnia do uznania hodowli za dodatnią.
8. Zawiesinę bakteryjną z dodatnich hodowli w próbkach z podłożem Eijkmana (wybrać 2) przenieść ezą mikrobiologiczną do probówek z pożywką z zielenią brylantową. Hodowlę, z której pobiera się materiał, należy przed posiewem wymieszać, lekko wstrząsając.
9. Posiewy inkubować w temperaturze 44°C.
10. Odczyt wykonać po 18-24 godzinach (niektóre szczepy E. coli dają wynik pozytywny już po upływie 6-8 godzin inkubacji). O wyniku dodatnim świadczy zmętnienie pożywki z równoczesną obecnością gazu w rurkach Durhama lub w całym podłożu, przy lekkim wstrząsaniu. W przypadku wyniku ujemnego po 24 godzinach hodowlę należy inkubować w ciągu następnych 24 godzin.
4