-metody izolowania i oczyszczania enzymów,

-oznaczanie i regulowanie aktywności enzymatycznej,

Podstawą do okręślenia aktywności enzymu jest pomiar szybkości reakcji enzymatycznej przez oznaczenie stężenia wytworzonych produktów lub ubytku substratu.

Każda cząsteczka enzymu ma jakąś max. szybkość pracy, czyli szybkość reakcji chemicznych, jakie może przekatalizować w czasie 1s. Ograniczeniem są tu czsy potrzebne na subtelną zmianę ustawienia przestrzennego cząsteczek enzymu w trakcie przyłączania substratów, a następnie odłączenia produktów. W przypadku enzymów nie podlegającym mechanizmom reagulacji owa max szybkość pracy jest w zasadzie stała. W przypadku enzymów podlegających regulacji-aktywność enzymu może się zmieniać. Aktywność enzymu może być hamowana lub pobudzana zazwyczaj przez różne związki chem. wyst. w komórce.

Aktywność węzłowego enzymu często decyduje o szybkości określonego szlaku metabolicznego, dlatego pojęcia: aktywność enzymu i aktywność szlaku są do pewnego stopnia wymienne. Podstawowym mechanizmem regulacji szybkości szlaku jest hamowanie początkowej reakcji szlaku przez produkt końcowy: ABCDE ->doA -hamowanie

W powyższym przykładzie punkt końcowy szlaku E hamuje początkowy etap jego syntezy AB. Taki mechanizm zapobiega nadmiernej produkcji jakiegoś związku, z którym następnie nie byłoby co robić. Zapewnia również,że przy braku związku końcowego jego synteza zostanie odblokowana.

Wpływ hamujący (pobudzający) zwiążków chemicznych na enzym może być dwojaki. Mogą one zmieniać ilość cząsteczek enzymu w komórce oraz zmieniać aktywność cząsteczek enzymu już istniejącego.

W pierwszym przypadku-zmiana ilości cząsteczek enzymów zachodzi najczęściej poprzez zahamowanie jego syntezy. Procesy syntezy i rozkładu enzymu są nieco rozłożone w czasie, stąd efekty tego typu regulacji nie są natychmiastowe.

W drugim przypadku- zmiana aktywności enzymu zachodzi najczęściej w ten sposób, że zwiążek końcowy szlaku przyłącza się do cząsteczki enzymu zmieniając jej kształt, w tym kształt centrum aktywnego. Powoduje to zmianę aktywności danego enzymu, majczęściej zmniejszenie tej aktywności. Tego typu efekt jest w zasadzie natychmiastowy.

Szybkość reakcji enzymatycznej zależy w dużym stopniu os wielu czynników hamujących, obecnych w środowisku. Czynniki te można podzielić na specyficzne i niespecyficzne. Do działających niespecyficznie należą czynniki fizyczne jak zmiana pH, podwyższenie temp., oraz czynniki chemiczne jak niektóre rozpuszczalniki organiczne, stężone roztwory soli metali ciężkich, niektóre kwasy aromatyczne. Czynniki te powodują denaturację białka enzymatycznego, a więc działają nieodwracalnie i są nazywane inaktywatorami, a proces niespecyficznego i nieodwracalnego hamowania inaktywacją.

Czynniki chemiczne, które działają modyfikująco na określony fragment cząsteczki enzymu, powodując zmniejszenie szybkości reakcji. Są to inhibitory, a zjawisko specyficznego hamowania jest nazywane inhibicją.

Inhibicja polega na tym, że określona substancja (inhibitor) blokuje współdziałanie składników uczestniczących w reakcji enzymatycznej, łącząc z jednym z nich, lub w inny sposób. Do składników tych należą: enzym, substrat, koenzym, a ich współdziałanie polega na wzajemnym powiążaniu w ściśle określony układ przestrzenny. Zakłócenia w tworzeniu tego układu są przyczyną zahamowania reakcji.

Inhibicja wspólzawodnicząca polega na konkurencji między między inhibitorem I a substratem S o centrum aktywne enzymu a) E+SESE+P b) E+IEI

Ponieważ zgodnie z 2 reakcją, inhibitor wiąże przejściowo część znajdujących się w roztworze cząsteczek enzymu, musi nastąpić zmniejszenie szybkości reakcji właściwej. Inhibitor ma w tym przypadku strukturę podobną do substratu, ale kompleks EI nie jest zdolny do dalszej przemiany w produkt. Typowym przykładem inhibicji współzawodniczącej jest hamowanie przemiany bursztynu do fumaranu, katalizowanej przez dehydrogenazę bursztynianową.

Inhibicja niewspółzawodnicząca stopień hamowania reakcji zależy tylko od dwóch czynników: od stężenia i od powinowactwa enzymu do inhibitora. Inhibicja ta może polegać zarówno na tworzeniu kompleksu enzymu z inhibitorem wg. reakcji (b), która jednak w tym przypadku nie jest łatwo odwracalna lub na przyłączeniu inhibitora do kompleksu ES w reakcji ES+IESI. W obu przypadkach odwrócenie reakcji może nastąpić jedynie przez związanie inhibitora ze związkiem o większym powinowactwie od niego ESI+XES+XI

-mechanizm, specyficzność i kinetyka działania enzymów,

Przy połączeniu cząstki substratu z enzymem przebiega jego aktywacja w następstwie polaryzacji, przemieszczania elektronów lub deformacji wiązań uczestniczących w reakcji. Uważa się że ma tu miejsce określona cząsteczki substratu i podwyższenie jego zdolności do reakcji wskutek naprężania, rozciągnięcia, polaryzacji wiązań lub inicjowanie procesów łańcuchowych.

Przy tworzeniu i dalszych zmianach kompleksu enzym -substrat wyróżniamy następujące etapy:

-przyłączenie cząsteczki substratu do cząsteczki katalizatora

-przekształcenie powstałego połączenia, które zachodzi przez utworzenie jednego lub kilku kolejnych pośrednich aktywnych kompleksów

-odłączenie uzyskanych produktów reakcji od enzymu.

Przyłączenie enzymu do substratu przebiega zwykle najszybciej. To stadium wykazuje zwykle bardzo małą energię aktywacji, czyli początkowy kompleks tworzy się przy udziale słabych wiązań-wodorowych, hydrofobowych. Drugi etap wymaga dużej energii, ponieważ jest on związany z rozpadem i utworzeniem nowych kowalencyjnych wiązań.

Każdy enzym działa tylko na jeden ściśle określony związek lub na grupę związków o określonej strukturze. Ta właściwość enzymu jest określana jako specyficzność.

Wyróżniamy 4 typy specyficzności:

-absolutna-enzym katalizuję przemianę 1 konkretnego substratu

-grupowa-katalizuję hydrolizę wszystkich białek, ale ma pewne wymagania co do budowy wiązania na które działa niezależnie w jakim substracie się znajduje.

-względem określonego typu reakcji

-stereochemiczna-enzymy działają na określone formy stereospecyficzne.

Kinetyka reakcji chemicznych określa zachowanie się reakcji w czasie ich trwania. Szybkość reakcji mierzy się w jednostkach substratu, który przereagował lub produktu, który powstał w jednostce czasu w reakcji.

Zadaniem kinetyki jest ustalenie charakteru reakcji i matematyczne ujęcie zależności pommiędzy szybkością reakcji a czasem jej trwania. Na szybkość reakcji mają wpływ: budowa i charakter chemiczny związku, pH środowiska, temperatura oraz stęzenie reagujących substancji (enzymu wobec substratu).

Reakcje enzymatyczne w odróżnienieniu od reakcji nieenzymatycznych mogą w określonych warunkach przebiegać ze stałą prędkością niezależnie od stężenia substratu. Szybkość ta mierzona w danym czasie jest równa szybkości początkowej. W ujęciu kinetycznym są to reakcje rzędu zerowego. Zjawisko to wyjaśnił Michaelis zakładając że enzym E łączy się z substratem S i powstały kompleks ES jest w ścisłym znaczeniu tego słowa substratem reakcji. v= k_*ES

-specyficzność działania enzymów hydrolitycznych.

---