Temat 2: Diagnostyka molekularna chorób genetycznych cz I.. Zastosowanie technik biologii molekularnej w diagnostyce chorób.
Pozyskiwanie DNA do celów diagnostycznych.
Pobieranie i przechowywanie materiału biologicznego.
Zasady izolacji DNA i RNA
R. Łańcuchowe polimerazy PCR
Analiza produktu r. PCR
Ocena ekspresji genów z zastosowaniem mikro- i makromacierzy DNA
Materiał wyjściowy do izolacji DNA
pełna krew obwodowa
komórki płynu owodniowego
komórki kosmówki
fibroblasty skory pochodzącej z hodowli
komórki epitelialne
cebulki włosowe
plamy krwi, nasienie
wycinki tkanek np. tk. Nowotw. Uzyskiwane pooperacyjnie, pobrane met. Biopsji cienkoigłowej
szpik kostny
płyn mózgowo-rdzeniowy
Krew pobieramy na antykoagulant (EDTA, 2,3 ml krwi)
Przechow. - w temp 4 st. do 48 godz, jeśli od pacjenta - zamrażamy do - 70 st
Plamy z wydzieliny w temp. pokojowej
Wyizolowany DNA w temp - 4st, jeśli dłużej przechow. to w - 20st
Etapy izolacji DNA met. fenolowa
pobieranie krwi obwodowej na EDTA
oddzielenie osocza przez wirowanie
liza erytrocytów
liza leukocytów z wykorzystaniem detergentu jonowego np. SDS, która rozpuszcza bł. kom.
trawienie białek przy użyciu proteinazy K w temp 37st., 24- 48 godz. (najczęściej przez noc)
oczyszczenie lizatu mieszanina fenol- chloroform- oktanol (25:24:1)
precypitacja DNA (wytracanie) 96% etanolem
zawieszenie preparatu DNA w buforze, który zabezpiecza przed działaniem endonukleaz
DNA otrzymany tą met. może być wykorzystany w podst. badaniach diagnostycznych z zakresu biologii molekularnej.
Zalety met. Fenolowej
dobra wydajność - otrzymuje się DNA o dużym stężeniu
wysoka czystość otrzymanego preparatu
możliwość izolacji DNA z krwi długo przechowywanej (ok. 1 roku)
Wady met. Fenolowej
długi czas izolacji - 2-3 dni
naraża na prace z toksycznymi odczynnikami
Metoda z odsalaniem białka
Różnice w stosowaniu do metody fenolowej
wyższa temperatura inkubacji z proteinaza K - 55st
skrócony czas trwania do 12- 24 godz., a tym samym i czas uzyskania preparatu DNA
odbialczenie DNA zachodzi w wyniku odsalania białek poprzez odwodnienie i wytracenie z użyciem nasyconego roztworu NaCl
precypitacja 70%etanolem
Zalety stosowania metody wysalania
prosta i tania
krótszy czas izolacji - 2 dni
rezygnacja z toksycznych odczynników
możliwość zmniejszenia ilości pobranej krwi
Wada: niska wydajność izolacji DNA z krwi długo przechowywanej
Metoda Grimberga
Zalety
rezygnacja z fenolu i chloroformu
krotki czas izolacji - 6godz
duża wydajność
możliwość uzyskiwania DNA z bardzo małych ilości krwi ok. 1 ml
Wady:
zanieczyszczenie preparaty DNA glikozoaminoglikanami, brak zanieczyszczeń RNA i białkami
nie nadaje się do izolacji z izotiocyjaninem guanidyny
Metoda izolacji z izotiocyjaninem guanidyny
Zalety:
krotki czas wykonywania - kilka godz.
wydajność przekracza prawie 2- krotnie wydajność tradycyjnej met. Fenolowej
Metoda izolacji za pomocą gotowych zestawów odczynnikowych tzw. KIT-ow
Gotowe zestawy służą do szybkiej i uproszczonej izolacji DNA, upraszczają procedury, ale są bardzo drogie.
Ocena ilości i jakości wyizolowanego DNA
Na podstawie pomiaru absorpcji 260nm oblicza się stężenie preparatu DNA wg. wzoru
Z= A260 x 50 x R
Z - stężenie wyizolowanego DNA w roztworze (ug/ml)
R - rozcieńczenie
50 - stały współczynnik dla dwuniciowego DNA. Jedna jednostka absorpcyjna równa się 50 ug DNA/ml
Częstość preparatu ocenia się na podstawie proporcji wartości absorbancji przy długości fali 230 nm, 260nm, 280nm.
Uzyskany preparat DNA charakteryzuje się wartości.
A260/A280 wynosząca 1,7- 2,0
A260/A280 <2 preparat zanieczyszczony RNA i białkiem
A260/A230 >2 preparat zanieczyszczony mukopolisacharydami
Izolacja RNA:
pobranie krwi na antykoagulant (EDTA)
„zbieranie” leukocytów - nawarstwianie fikolu
Odwirowanie - pozostaje zawiesina leukocytów
Płukanie leukocytów w roztworze PBS
Wirowanie
Dodanie PBS i tiocyjanianu guanidyny
Wirowanie
Właściwe oczyszczanie - dodajemy azotanu sodu, fenolu i mieszaniny chloroformu z alkoholem izoamylowym
Inkubacja 0C przez 15min
Wirowanie i płukanie alkoholem
Przechowywanie w buforze lub sterylnej wodzie
Oznaczenie stężenie spektrofotometrycznie
Technika sekwencjonowania na żelach (elektroforeza)
DNA migruje w kierunku bieguna dodatniego
Najmniejszą rozdzielczość mają żele agarozowe - 0,1-60kpz
Wykorzystanie:
Sprawdzenie, jaki preparat DNA uzyskaliśmy
Czy badane DNA zostało pocięte przez enzymy
Do oceny reakcji PCR
Żel poliakrylamidowy: duża rozdzielczość, >0,1 kpz,
Żele PAGE - do rozdziału DNA otrzymanych podczas sekwencjonowania, gdzie cząsteczki DNA różnią się od siebie o 1 nukleotyd
Łańcuchowa reakcja polimerazy
PCR- enzymatyczna amplifikacja in vitro fragmentu genów DNA o długości od kilkudziesięciu do kilku tysięcy par zasad.
Startery - jednoniciowe oligonukleotydy (ok. 20 zasad), syntetyzowane chemicznie Sekwencja nukleotydów jest komplementarna do końców 3' obu nici wybranej sekwencji matrycowego fragmentu DNA, które ma być powielona z wielokrotnej kopii.
Amplifikacja DNA w reakcji PCR odbywa się przy udziale polimerazy DNA wyizolowanej z termofilnych bakterii np. polimeraza Tag z Thermas aquaticus jest aktywna w mieszaninie reakcyjnej o temp. 95 st.
Reakcja PCR prowadzona jest w cyklach powtarzających się 20 - 40 razy. W każdym cyklu następuje etap denaturacji cząsteczki DNA, przyłączanie starterów i syntezy nowej nici DNA. Każdy etap zachodzi w innej temperaturze i trwa ok. 15- 60 sek.
Reakcja zachodzi w próbówce umieszczonej w bloku grzejnym (termocykler), który umożliwia szybka i precyzyjna zmianę temperatury, właściwa dla poszczególnych etapów procesu PCR.
Skład mieszaniny reakcyjnej:
Matrycowy DNA (lub RNA)
Startery komplementarne do łańcucha i ograniczające długość syntetyzowanego łańcucha
Tri fosforany czterech deoksyrybonukleotydów (dNTP)
Termostabilna polimeraza Taq
Odpowiedni bufor
Jony Mg2+ - ko faktor aktywności enzymatycznej polimerazy
Objętość mieszaniny reakcyjnej wynosi 20-100ul
Etapy reakcji PCR:
Denaturacja matrycowego DNA w temperaturze 94C
Przyłączanie starterów do jednoniciowych matryc DNA w temperaturze 40-68C (im więcej par GC tym wyższa temperatura przyłączania)
Synteza DNA - wydłużanie starterów przy udziale polimerazy Taq w temperaturze 72C z wykorzystaniem dNTP - elongacja
Podniesienie temperatury 72C po zakończeniu elongacji do temperatury denaturacji DNA rozpoczyna kolejny cykl, proces ten może być powtarzany 25-40x. Po każdym cyklu następuje podwojenie amplifikowanego materiału. Nowo powstające produkty PCR są również matrycą do syntezy następnych. Końcową ilość namnożonych kopii fragmentu DNA można obliczyć ze wzoru:
I=I0x2n ,gdzie:
I, I0 - końcowa i początkowa ilość kopii powielanego odcinka DNA
n - ilość cykli
zalety:
Szybka do przeprowadzenia: 2,5-4h
Klonowanie pojedynczych genów
b. duża czułość i specyficzność metody
wady:
b. duża czułość i specyficzność (przy zanieczyszczonej próbce, może to prowadzić do błędnych wyników)
zastosowania PCR:
wykrywanie patogenów infekcyjnych: bakterii, wirusów, pasożytów
wykrywanie zmian w genomowym DNA w chorobach genetycznych
preimplantacja i prenatalna diagnostyka chorób genetycznych
wykrywanie uszkodzeń DNA spowodowanych czynnikami środowiskowymi
wykrywanie predyspozycji do chorób nowotworowych, monitorowanie i wykrywanie nowotworów
wykrywanie polimorfizmu sekwencji DNA na potrzeby identyfikacji indywidualnej, ustalanie ojcostwa, identyfikacja sprawców przestępstw
badania głównego systemu zgodności tkankowej w celu prawidłowego doboru dawców i biorców
Warianty reakcji PCR:
rt-PCR:
proces PCR jest poprzedzany przepisaniem sekwencji mRNA na cDNA w reakcji odwrotnej transkrypcji. Jest to technika amplifikacji genów, w której materiałem wyjściowym jest mRNA lub całkowity RNA komórki
Multiplex PCR
Wielomiejscowa reakcja PCR, umożliwia jednoczasową amplifikację kilku fragmentów DNA w mieszaninie reakcyjnej
Nested PCR
Wewnętrzna reakcja PCR: prowadzi się dwie rundy reakcji, do każdej stosuje się dwie pary primerów: zewnętrznych i wewnętrznych, tak że druga para jest umieszczona wewnętrznie w stosunku do pierwszej. Pierwsza runda to standardowe PCR prowadzona przez 15-20 cykli. Mała porcja tak otrzymanej mieszaniny reakcyjnej jest rozcieńczana i poddawana drugiej rundzie amplifikacji przez 15-20 cykli. Poprawia się dzięki temu specyficzność i czułość reakcji PCR
Real time PCR
Tzw „w czasie rzeczywistym”, po każdej replikacji (powieleniu) informuje ile jest kopii DNA