NMR

Integracja - wyraża pole powierzchni pod sygnałem. Jest proporcjonalna do ilości protonów tworzących sygnał. Jest wielkością bezwymiarową. Wzajemny stosunek integracji poszczególnych sygnałów pozwala na obliczenie ilości protonów których obrazem są poszczególne sygnały

Jądrowy efekt Overhausera - transfer energii wzbudzenia z jednych jąder a drugie na skutek zakłócenia przejść pomiędzy poziomami energetycznymi. Zachodzi pomiędzy jądrami oddziaływującymi ze sobą dipolowo. Jest tym skuteczniejszy im bliżej znajdują się oddziaływujące jądra.

Wpływ na intensywność sygnału w widmie ¹³C:

- sygnał odprzęgania wprowadza atomy H w wyższy stan energetyczny

- znajdujące się w stanie wzbudzonym jądra ¹H przekazują sąsiednim jądrom stan wzbudzenia

- transfer energii odbywa się poprzez przestrzeń na skutek oddziaływania dipol-dipol

- na skutek dodatkowej porcji energii atomy C związane z większą liczbą wodorów emitują silniejszy sygnał i tworzą intensywniejsze piki na widmie

Magnetyczny rezonans jadrowy - wykorzystuje zjawisko absorpcji i emisji energii w postaci fali elektromagnetycznej o częstotliwości radiowej przez jądra określonych izotopów, umieszczonych w silnym polu magnetycznym.

Zastosowanie:

a) chemia organiczna

- identyfikacja i ustalanie struktury związków organicznych

- badanie oddziaływań na poziomie cząsteczkowym

b) biochemia i biologia molekularna

- badanie struktur kwasów nukleinowych

- oddziaływanie biomolekuł z ligandami

c) medycyna

- tomografia obrazowa

- NMR

Przesuniecie chemiczne- to różnica częstotliwości rezonansowej protonu lub grupy protonów w stosunku do częstotliwości rezonansowej wzorca (TMS). Wyrażamy je w ppm (part per milion).

Związanie ze szkieletem węglowym:

- zależy od hybrydyzacji at C

- zależy od polarności grup funkcyjnych w sąsiedztwie

- podobne podstawniki w podobny sposób wpływają na przesunięcie

- w niewielki sposób zależy od rodzaju rozpuszczalnika, stężenia próbki i sposobu wykonania eksperymentu

- ostre, dobrze zarysowane piki

- liczbę protonów w sygnale pokazuje integracja

- sygnały protonów o podobnym przesunięciu mogą się nakładać

Związane z heteroatomami:

- zależy od rodzaju grupy funkcyjnej

- słabo zależy od rodzaju rozpuszczalnika, stężenia próbki i sposobu wykonania eksperymentu

- piki są najczęściej mało ostre bądź rozmyte

- integracja może być zaniżona

- w niewielkich polarnych deuterowych rozpuszczalnikach sygnał protonów związanych z heteroatomami może być niewidoczny

Protony równoważne- protony w łańcuchach alifatycznych o swobodnej rotacji. Protony w związkach symetrycznych. Protony w cząsteczkach o labilnej szybko zmieniającej się konformacji. Protony równocenne (równoważne) posiadają jednakowe przesuniecie chemiczne. Protony równcenne w jednakowy sposób oddziałują z jądrami sąsiednimi i mają taką samą stałą sprzężenia J.

Przygotowanie próbki do eksperymentu NMR- standardowe szklane rurki o średnicy od 4 do 10 mm; 1-10mg związku organicznego rozpuszczonego w deuterowym rozpuszczalniku (0.5-2ml); substancja wzorcowa dodawana jako wzorzec wewnętrzny lub zewnętrzny; tetrametylosilan lub sulfonian tetrametylosilanu

Sprzężenie spinowo - spinowe - to rozszczepienie sygnału protonu lub grupy protonów na kilka linii tworzących multiplet, na skutek oddziaływania z sąsiednimi jądrami o właściwościach magnetycznych. Odległość między sąsiednimi liniami w multiplecie, zmierzona w Hz nazywana jest stałą sprzężenia J. Analiza sprzężenia spinowo- spinowego dostarcza istotnych informacji o budowie związku.

- może być przekazywane za pośrednictwem wiązań chemicznych lub przez przestrzeń dla jąder znajdujących się blisko w przestrzeni ale nie połączonych wiązaniami chemicznymi

- może zachodzić pomiędzy jądrami tego samego rodzaju np. H-H lub różnymi jądrami H-P

- nie zależy od sposobu wykonania eksperymentu i siły pola magnetycznego

Mechanizm:

- stan magnetyczny sąsiadujących jąder wpływa na spin elektronów walencyjnych wokół tych jąder i za pośrednictwem wiązań chemicznych jest przekazywany na elektrony walencyjne analizowanego jądra

- w ten sposób częstotliwość rezonansowa analizowanego jądra jest odzwierciedleniem stanów energetycznych jąder sąsiednich

- silniejszy wpływ (łatwość przekazywania sygnału) stanu energetycznego jąder sąsiednich wyraża się zwiększeniem wartości stałej sprzężenia

Właściwości sss:

- miarą sił ss-s jest stała sprzężenia J wyrażona w Hz

- stała sprzężenia zależy od rodzaju jąder

- stała sprzężenia zależy od rodzaju i ilości wiązań chemiczn pomiędzy oddziaływującym jądrami

- wiązania wielokrotnie zwiększają wartość stałej ss-s

- stała s zależy od konformacji cząsteczki, wzajemnego usytuowania jąder

- stała s przenosi się z taką samą siłą w obu kierunkach oddziaływujących jąder

ss-s nie obserwujemy:

- gdy jądra oddzielone są o wiecej niż 5 wiązań

- gdy protony są równoważne chemicznie

- gdy w łańcuchu sprzężenia występuje heteroatom (wyjątek stanowią układy heterocykliczne)

- gdy proton związane są z heteroatomami (wyjątek stanowią protony amidowe)

- gdy różnica przesunięć chemicznych jest mniejsza od stałej sprzężenia

- gdy czułość aparatu jest mniejsza od stałej sprzężenia

- gdy sprzęgające się grupy ulegają szybkim zmianom konformacyjnym

Stopień nienasycenia - ile cząsteczek (H₂) trzeba przyłączyć do danego związku organicznego by przekształcić go w liniowy związek nasycony. Wyraża ilość wiązań wielokrotnych lub układów cyklicznych w czasteczce N=(n_IV+1)-n₁/2+n_III/2

Podobieństwa w spektrometrii ¹H i ¹³C NMR

- kwantowa spinowa liczba magnetyczna ½

- widmo wykonywane w tej samej aparaturze

- widmo wykonywane metodą impulsową

- identyczny sposób wykonania próbki - rozpuszczenie w deuterowskim rozpuszczalniku

- ten sam wzorzec częstotliwości TMS

- możliwość wykonania widma z tej samej próbki (przy odpowiednio dużym jej stężeniu)

- podobne czynniki wpływające na przesuniecie (hybrydyzacja At C, polarność podstawników w otoczeniu)

Różnice w spektrometrii ¹H i ¹³C NMR

^1H NMR	^13C NMR
- ilość substancji niezbędna do wykonania widma <1mg - bardzo czuły i łatwiejszy do wykonania - ilość linii w multiplecie jest zależna od ilości protonów związanych z sąsiednim atomem C	- >1mg na każdy atom C w analizowanym związku - wymaga dłuższego czasu do otrzymania ^13C spectrum - ilość linii w multiplecie jest zależna od ilości protonów bezpośrednio związanych z danym C

Sposoby rejestracji widma NMR

1. absorpcyjny

- próbkę naświetlamy promieniowaniem radiowym o wąskim zakresie częstotliwości

- płynnie zmieniamy częstotliwość

- mierzymy ilość pochłoniętego promieniowania

- rejestrujemy widmo

2. emisyjny

- próbkę naświetlamy krótkim silnym impulsem promieniowania radiowego o szerokim zakresie częstotliwości

- próbka pochłania energię i przechodzi w stan wzbudzony

- próbka powraca do stanu normalnego emituje widmo

- akumulujemy kilkaset sygnałów

- dokonujemy transformacji Furiera

- rejestrujemy obliczone widmo

Zalety i wady obu metod

Wady: prostota techniczna i obliczeniowa; mało precyzyjna; konieczne wysokie stężenie badanego związku; ma znaczenie gł historyczne

Zalety: pozwala wykonywać widma z miligramowych ilości związku; można akumulować tysiące impulsów; pozwala na stosowanie zaawansowanych technik (2D, 3D odprzęganie); pozwala na rejestrację widm izotopów śladowych np. ¹³C; widma absorpcyjne i emisyjne są praktycznie identyczne; nie zmieniają się- przesunięcia chem stałe sprzężenia integracja; wymaga skomplikowanej aparatury i oprogramowania

Zalety wzorca- 1. silny sygnał 12 protonów na krawędzi widma 2. dobra rozpuszczalność w większości rozpuszczalników organicznych 3. łatwy do usuniecia - niska temp wrzenia 4. nieaktywny względem innych związków 5. uniwersalny wzorzec do ¹H₁ jak i ¹³C NMR

SPEKTROMETRIA MASOWA

Analizatory m/z

- magnetyczny

- magnetyczno - elektrostatyczny - wykorzystuje zjawisko zmiany toru lotu jonów w polu magnetycznym; posiada małą rozdzielczość

- czasu przelotu (TOF) - jon wprowadzony do niego przyspiesza przy pomocy impulsu elektrycznego i zaczyna dryfować przez komorę analizatora

- kwadrupolowy - działa jak filtr masy- w jednym momencie przepuszcza tylko jony o określonym stosunku masy do ładunku (m/z)

- pułapka jonowa - pozwala na przetrzymywanie jonów i działa na zasadzie podobnej do kwadrupola

- liniowa pułapka jonowa - pomiar masy odbywa się przez wyrzucenie jonów o kreślonym m/z z analizatora i detekcję

- cyklotronowy analizator jonów z transformacją Fouriego - wykorzystuje zjawisko toru lotu w polu magnetycznym

Budowa spektrometru masowego

Panuje tam wysoka próżnia- minimum 10^-7Tr

Układ wprowadzenie próbki -> komora jonizacji -> analizator m/z -> detektor -> system rejestracji danych

Detektory

Def.: Zadaniem detektora w spektrometrze mas jest rejestracja jonów, przechodzących przez analizator. Najprostszym i najstarszym detektorem jonów jest płyta fotograficzna. Obecnie płyty fotograficzne zostały zastąpione detektorami przekazującymi informację w postaci sygnałów elektrycznych. Sygnały te są we współczesnych spektrometrach mas przetwarzane na postać cyfrową i dalej analizowane i przechowywane z wykorzystaniem komputerów. Można wyróżnić kilka najczęściej stosowanych typów detektorów

1. puszka Faradaya - jest to metalowa, cylindryczna komora z otworem przez który wlatują jony. Jony wpadające do detektora trafiają na dno puszki i oddają swój ładunek. Powstający w ten sposób prąd jest mierzony. detektor posiada małą czułość

2. powielacz elektronów - detektor zbudowany jest z serii płytek, do których przyłączono wysokie napięcie. Jony po uderzeniu w pierwszą płytkę (dynodę konwersyjną), powodują emisję elektronów. Elektrony te uderzają w kolejną płytkę (dynodę) powodując wybicie większej liczby elektronów. Z każdej, kolejnej płytki detektora wybijane jest coraz więcej elektronów - sygnał jest wzmacniany. Elektrony trafiają ostatecznie na anodę powodując przepływ prądu, który jest mierzony. W nowszych konstrukcjach powielaczy elektronowych serię dynod zastępuje się zakrzywioną zwężającą się rurą (powielacz elektronowy o dynodzie ciągłej). Elektrony uderzają wielokrotnie w ściany rury powodując emisję kolejnych elektronów. Dzięki kaskadowemu wzmocnieniu sygnału powielacze elektronowe są detektorami bardzo czułymi.

3. mikrokanalikowy - detektor zbudowany z płytki z niewielkimi (4-25 μm), zakrzywionymi otworami. Powierzchnia otworów pokryta jest półprzewodnikiem mającym zdolność emisji elektronów. Na stronie wejściowej płytki utrzymywany jest potencjał ujemny (napięcie rzędu 1 kV) w stosunku do strony wyjściowej. Jony wpadają do kanalików i zderzają się ze ścianami otworów powodując kaskadową emisję elektronów, podobnie jak w powielaczu elektronowym. Za każdym z kanalików znajduje się metalowa anoda zbierająca elektrony. Sygnał powstały w ten sposób jest mierzony.

4. fotopowielaczowy - składająca się z dwóch dynod konwersyjnych (jedna dla jonów dodatnich druga dla jonów ujemnych), ekranu fluorescencyjnego i fotopowielacza. Jony wpadające do detektora uderzają w dynodę konwersyjną powodując emisję elektronów. Elektrony są kierowane na ekran fluorescencyjny przy pomocy pola elektrycznego. Po uderzeniu elektronu w ekran emitowane są fotony, które trafiają do fotopowielacza. Wzmacnia on sygnał, który potem jest rejestrowany.

5. cyklotronowego rezonansu jonów - Analizatory ICR są jednocześnie detektorami jonów, nie wymagają one instalacji dodatkowych detektorów

MS - zbiór technik analitycznych które polegają na przeprowadzeniu próbki w stan zjonizowany i analizie powstałych jonów z uwzględnieniem stosunku ich masy do ładunku.

Metody wprowadzania próbki:

- wprowadzenie bezpośrednie (mikrocylinder, płytka)

- wlot zimny

- wlot gorący

- układ wprowadzania z chromatografu gazowego

- układ wprowadzania z chromatografu cieczowego (taśmowy, spray)

Metody jonizacji

1. elektronami (EI) - przy pomocy wiązki elektronów; odbywa się w próżni; powoduje fragmentację badanych cząstek; jest mało wydajna

2. chemiczna (CI) - jony wytwarzana na skutek zderzeń cząstek badanego związku chemicznego; brak fragmentacji; przy ciśnieniu 60 Pa

3. bombardowanie szybkimi atomami (FAB) - cząstka bombardowana obojętnymi atomami o wysokiej energii; cząsteki mogą znajdować się w fazie lotnej lub być rozpuszczone w fazie ciekłej

4. spektrometria masowa jonów wtórnych (SIMS) - stosuje się ją do substancji nie przewodzących prądu

5. desorpcja laserowa (LD) - przez naświetlenie próbki silnym laserem, a zatem bombardujemy cząstki wysokoenergetycznymi fotonami

6. termorozpylanie (TE) - przez podgrzanie przy pomocy prądu elektrycznego roztworu zawierającego sól i analizowaną substancję wewnętrz stalowej kapilary; gorąca sub rozpylana w komorze próżniowej z prędkością naddźwiękową

7. desorpcja laserowa z udziałem matrycy (MALD)

8. elektrorozpylanie (ESI)

Rodzaje pików na widmie masowym

1. molekularny - odpowiada masie cząsteczkowej badanego związku, przy założeniu że cząsteczka zbudowana jest z najlżejszych izotopów

2. pozorny pik molekularny - odpowiada masie badanego związku powiększonego o masę czynnika jonizującego

3. izotopowy - odpowiadający masie badanego związku w którego cząsteczce jeden lub więcej atomów zostało zastąpione cięższymi izotopami

4. główny - najwyższy pik na widmie, intensywność 100%

5. fragmentacyjne - powstałe na skutek rozpadu cząsteczki w wyniku jonizacji

---