KOTY:ART.-techniki rozrodu wspomaganego medycznie-gr.różnorodnych metod terapeutycznych majacych na celu uzyskanie ciązy z pominieciem jednego lub kilku etapow naturalnego rozrodu:sztuczna inseminacja(AI),pozaustrojowe dojrzewanie komorek jajowych(IVM),zaplodnienie pozaustrojowe(IVF),pozaustrojowa hodowla zarodków(IVC),transfer arodków(ET),kriokonserwacja zarodkow. Techniki te kluczowa rola w ratowaniu populacji ginacych kotowatych.Kot-dobry model bo:podobienstwo cyklu,ciazy,procedur,dziesiatki tysiecy usuwanych gamet. Pobieramy nasienie i oocyty-kriokonserwacja-zaplodnienie-dojrzewanie zarodka.
Pozyskiwanie oocytow:in situ dojrzale,ex situ niedojrzale-dojrzewanie in vitro-zaplodnienie pozaustrojowe-hodowla pozaustrojowa-transfer zarodkow. Pozyskiwanie nasienia;in situ kateteryzacja cewki moczowej,ex situ nacinanie najadrzy- zaplodnienie pozaustrojowe-hodowla pozaustrojowa-transfer zarodkow. Środowisko:dojrzewanie kom i hodowla zarodkow:5%CO2 w 38.5c 1.pozyskiwanie oocytow in situ:stymulacja jajnikow-superowulacja-dojrzewanie oocytow in vivo-pozyskiwanie oocytow-pozyskiwanie oocytow-zaplodnienie bez koniecznosci dojrzewania in vitro-nabieraja kompetencji in vivo 2.pozyskiwanie KJ i situ:A)laparoskopia/laparotomia-ocena pecherzykow-aspiracja B)transwaginalna z USG-płytki petriego-mikroskop 3.pozyskiwanie KJ-ex situ:jajniki po OVH/post mortem-pozyskiwanie oocytow-odzyskiwanie KJ z otaczajacymi kom wzgorka jajonosnego-stadiumGV profaza I mejozy-niedojrzałe-dojrzewanie in vitro. Technika pozyskiwania KJ:2-6h po wycieciu gonad/do24h w 4c-naciecie warstwy korowej jajnikow-przeplukiwanie tkanki,filtrowanie-na plytki petriego-wyszukiwanie i ocena pod lupa imikroskopem
Plemniki:do procedur IVF:ejakulowane,najadrzowe,jadrowe. Pobieranie nasienia:sztuczna pochwa:kocur wytrenowany,pochwa:gumowa pipeta,mala probowka w buteleczce z woda37c,kocur na kotce pochwa na pracie, elektroejakulacja:znieczulenie medetomidyną 80ug/kg i.m. i ketamina 5mg/kg i.m.,usunac kał,sonda z 3 elektrodami na głębokość 6-8cm,seria bodzcow, kateteryzacja cewki moczowej:sedacja medetomidyna 100-150ug/kg -stymulacja rec L2-adenergicznych,nasienie do cewki pobierane przy uzyciu cewnika, wypłukiwanie nasienia z najadrzy: po kastracji jadra i najadrza na plytke petriego,oddzielamy jadra od naj.,do medium(tris)10min,wirowanie
Ocena nasienia:makro:obj(0.03-0.3),barwa,konsystencja(100-5000mln/ml),zapach,zanieczyszczenia,osad,pH, mikro:%o ruchu praw(56-85%),aglutynacja,zywy-martwy,morfo>60%,calkowita liczba3-160mln
Konserwacja nasienia:w stanie plynnym:2-4 dni zywotnosc +5c,mrozenie:słomki, rozrzedzalnik:zoltko,tris,glukoza,glicerol,mrozenie 120min:rozrzedzenie w medium-schlodzenie i ekwilibracja,wypelnienie slomek i mrozenie 120c 10min
KOTY-dojrzewanie pozaustrojowe-embriotransfer
inkubacja-24-26h,selekcja doj.kom.jaj.
IVM-in vitro maturation-kompleks procesów-imitowanie dynamicznych zmain w pęcherzyku przed owulacją i jajowodzie po owulacji - uzyskanie płodnej kom.jaj.Warunki powinny - podtrzymywać funk.cytoplazmy i cumulus,przemiany materiału jądrowego,interakcji cumulus-oocyt.Krople medium,war.mikroaerofilne,38,5st.Medium-zbuforowane dwuwęglanami,cukry,
białka,FCS,hormony(FSH i LH),antyoksydanty,antybiotyki
Dojrz.Plemn.-indukcja kapacytacji-pozbawienie plemn.cz.osoczowych-otoczki białkowej i Dfs- wirowanie nasienia i odrzucenie osocza-resuspensja w medium(Ca2+,białka)- destabilizacja błon (napływ jonów Ca)
IVF-in vitro fertilization-ko-inkubacja gamet ż (kompetentne oocyty) i m (plem.skapacytowane) pozwalająca na zapłodnienie kom.jaj. Na drodze naturalnych mech.Koncentracja plemn.4x10do6 o ruchu postępowym/ml (nasienie świeże) lub 1x10do6 po konserwacjim Musi być powyj 10 oocytów w 300ul medium + 100ul nasienia przez 18h to wszystko w medium zapłodnieniowym. Odsetek kom.jaj.podlegających podziałowi i kom.jaj.rozwijających się w blastocysty-40-70%.
Stosując kompetentne kom.jaj+seksowane plemn. = potomstwo określonej płci
ICSI-intracytoplasmatic sperm injection-plemnik wprowadzany jest do ooplazmy kom.jaj.przy użyciu mikromanipulatora przez nakłucie ZP i oolemy.Brak potrzeby kapacytacji i penetracji. Selekcja plemników do iniekcji-przygotowanie oocytów-usunięcie komórek wzgórka jajonośnego- umieszczamy oocyty w 2-5ul kropel pożywki a plemniki 5ul pożywki - iniekcja plemnika do oocytu. Stosuje się gdy :czynn.żeński upośledzenie migracji oocytów w jajowodzie,zaburzenia procesu owulacji,ciągły anoestrus,brak odpowiedzi na terapię hormonalną samic; czynn.męski: słaba jakość nasienia,asthenozoospermia,teratozoospermia,oligospermia,uszkodzony akrosom, upośledzenie AR,upośledznie reakcji plemnik-ZP,wykorzystane są również plemniki jądrowe i spermatydy,brak odpowiedzie na terapię hormo.
IVC-hodowla zarodków-przez 5-6 dni do uzyskania stadium blastocysty,co 24h sprawdza się pod mikroskopem odwróconym i zarodki,ktore uległy zatrzymaniu lub degeneracji usuwa się.-- stadium
2 blastomerów - 4 blastomerów - 6-10 blast. - 3 dnia do pożywek dodaje się substancje mające przełamać blok występujący na etapie moruli(FCS) - morula - blastocysty - zarodki w stadium późnej moruli lub blastocysty są odpowiednie do transferu do macicy biorczyń.
Embriotransfer-A)synchro.biorczyń:T 20-22st.,dzień świetlny 14h jasno - 10h ciemno, poprzez ruję wejście w fazę lutealną D1:3-5 UI FSH D2:3-4 D3:2-3 D4:2-3 lub D1:150UI eCG potem 85h od rozpoczęcia terapii 100 UI hCG B)przeniesienie :laparoskopia,TCC,laparotomia-wprowadzenie zarodków do rogu macicznego przy użyciu plastikowego kateteru(18G)-- zaszycie jamy brzusznej
Konserwacja oocytów i zarodków-A)Wolne mrożenie programowane-powolne obniżanie temp. W urządzeniu mrożącym”freezer” - media z 3-5% środków przenikających przez błony i 0,1M stęż cukrów,umieszcenie w słomkach - obniżenie temp od -6,5 do -7(seeding) - wolne obniżenie temo do -40(-0,3 do -0,5 na min) - szybkie do -150 - przeniesienie do LN2 B)Witryfikacja- zeszklenie- szybkie obniżenie temp powodujace bezpośrednie przejście ze stanu ciekłego w stały,ograniczające wytworzenie się kryształków lodu.Media o coraz wyższym stęż środków krioochronnych, osiągających w ostatnim etapie stęż 40% środ przenikający (glicerol,EG,DMSO) i 1,5M środ nieprzenikających (cukry,polimery i związki amfifilowe).Po bardzo szybkim przeniesieniu kom. na specjalny system witryfikacyjny (cryloop,cryotop) całość umieszcza się w ciekłym azocie.