ĆWICZENIE 6

Oznaczanie poziomu ekspresji genów przy użyciu względnej metody ilościowej real time PCR (analiza z barwnikiem EvaGreen) na platformie LightCycler 2.0.

W trakcie ćwiczenia oznaczony zostanie względny poziom ekspresji proapoptotycznego genu PUMA (p53-upregulated modulator of apoptosis). Genem referencyjnym będzie gen kodujący dehydrogenazę aldehydu 3-fosfoglicerynowego (GAPDH). Materiał wyjściowy stanowi cDNA otrzymany w wyniku reakcji odwrotnej transkrypcji z całkowitego RNA wyizolowanego z ludzkich komórek raka okrężnicy. Do analizy wykorzystano dwie izogeniczne linie komórkowe: posiadające białko p53 oraz z delecją kodującego je genu (HCT 116 i HCT 116 TP53^-/-). Komórki uprzednio potraktowano związkiem RITA - aktywatorem białka p53 typu dzikiego (wt-p53) w komórkach nowotworowych (Issaeva N, Nat Med, 2004).

W komórkach nowotworowych białko p53 uległo nadmiernej degradacji, przez co nie jest w stanie pełnić funkcji supresora nowotworzenia i indukować apoptozy. RITA to związek niskocząsteczkowy, który wiąże się bezpośrednio do białka p53 i zapobiega jego degradacji w proteasomach. Strategia przeciwnowotworowa oparta na związkach niskocząsteczkowych aktywujących wt-p53 w komórkach nowotworowych opiera się na zahamowaniu nadmiernej degradacji tego białka i indukcji selektywnej śmierci komórek nowotworowych na drodze p53-zależnej apoptozy.

1) Odwrotna transkrypcja

Procedura według Quanti Tect Reverse Transcription Kit (Qiagen®)

Reakcja odwrotnej transkrypcji (ang. reverse transcription, RT) stanowi wstępny etap poprzedzający technikę PCR w czasie rzeczywistym. Synteza komplementarnego DNA (cDNA) przeprowadzona zostanie na matrycy wyizolowanego całkowitego RNA. W reakcji odwrotnej transkrypcji wykorzystana zostanie zawarta w zestawie odwrotna transkryptaza oraz startery (6-ciomery) tzw. Random Hexamer Primers (RH) - amplifikujące losowe fragmenty RNA o rożnej długości.

Skład mieszaniny reakcyjnej:

1. Eliminacja DNA genomowego

- 2 µl buforu eliminującego DNA genomowy

- 1 µg matrycy RNA

- H₂O do końcowej objętości 14 µl

=

2. Odwrotna transkrypcja

- 1 µl odwrotnej transkryptazy

- 4 µl buforu dla odwrotnej transkryptazy

- 1 µl mieszaniny starterów RH

- 14 µl matrycy RNA (mieszanina reakcyjna z etapu eliminacji DNA genomowego)

Materiał badany stanowią dwie izogeniczne linie komórek raka okrężnicy: HCT 116 i HCT 116 TP53-/-

Badane próby: powyższe linie traktowane związkiem RITA

Kontrola (kalibrator): obie linie nietraktowane

2) Krzywa standardowa (optional):

W celu wykreślenia krzywej standardowej dla genów badanych należy przygotować następujące rozcieńczenia kalibratora (min. 20 µl każdego):

x1 (bez rozcieńczenia); x0,5; x0,05; x0,01

Każde z seryjnych rozcieńczeń standardu należy analizować w trzech powtórzeniach.

3) Oznaczenie względnego stężenia transkryptów genu referencyjnego GAPDH

Mieszanina reakcyjna:

• (5X) HOT FIRE Pol EvaGreen qPCR Mix Plus (1x)

• (0.5 pmol/ μl) startery (F + R) (2.5 pmol/reakcję)

• dH₂O

Należy dodać 10 µl mieszaniny do kapilar a następnie po 10 µl badanej próby (25 ng cDNA). Każda próba powinna być przygotowana w 3 technicznych powtórzeniach. Dodatkowo kontrola bez DNA (no template) powinna zostać przygotowana dla każdej pary starterów.

Po nałożeniu kapilary należy zamknąć i odwirować przy 1500xg/30 sec

Kapilary należy umieścić w karuzeli termocyklera.

Warunki reakcji PCR

• aktywacja 95°C 10 - 15 min

• 40 cykli („ramping” 20°C/sec):

- denaturacja 95°C 20 sec

- hybrydyzacja 60°C 50 sec (single fluorescent signal detection)

• końcowa denaturacja 95°C 60 sec

4) Analiza danych

Krzywa standardowa - wyznaczanie wydajności reakcji - E

Nieznana próbka (A) ΔCp_{s (sample)} = mean Cp tested gene - mean Cp reference gene

Nieznany kalibrator (B) ΔCp_{c (calibrator)} = mean Cp tested gene - mean Cp reference gene

ΔΔCp = (A) ΔCp_s - (B) ΔCp_c

2 ^-ΔΔCp e.g. 2³ = 8 eight times increase

2^-3=1/8 decrease

Spodziewane wyniki:

Związek RITA powinien indukować wzrost ekspresji genu PUMA w komórkach nowotworowych posiadających białko p53.

1

---