Barwienia bakterii - techniki stosowane w mikrobiologii, których celem jest umożliwienie obserwacji bakterii w mikroskopie świetlnym celem oceny ich wielkości, kształtu i niektórych cech morfologicznych. Barwienie jest konieczne ze względu na słaby stopień załamywania promieni świetlnych przez komórki bakterii.
Ze względu na to, co podlega barwieniu, wyróżnia się:
barwienie negatywne - polegające na barwieniu tła, a bakterie pozostają niezabarwione, np. Czerwienią kongo, nigrozyną, tuszem chińskim
barwienie pozytywne - polegające na barwieniu bakterii, z których przygotowany jest preparat np. Błękitem metylenowym, zielenią malachitową, fuksyną, safraniną.
Ze względu na ilość barwników zastosowanych przy barwieniu, wyróżnia się barwienie proste (z użyciem jednego barwnika) oraz barwienie złożone (stosuje się kolejno kilka barwników). Barwienie złożone ma większe znaczenie, gdyż umożliwia określenie nie tylko kształtu bakterii, ale także pozwala ocenić jej niektóre cechy morfologiczne. Przykładem barwienia złożonego jest barwienie według metody Grama, metody Ziehl - Neelsena, metody Schaeffera - Fultona.
Barwienie metodą Grama
Metoda Grama - metoda barwienia bakterii. Pozwala doświadczalnie zróżnicować te organizmy na dwie duże grupy (Gram-dodatnie i Gram-ujemne) ze względu na różnice w budowie ściany komórkowej oraz, co za tym idzie, także pewne różnice w fizjologii i podatności na leki.
Sposób barwienia
na odtłuszczone szkiełko podstawowe nanieść kroplę hodowli płynnej lub w przypadku hodowli stałej nanieść 1-2 krople soli fizjologicznej i wykonać rozmaz
szkiełko z rozmazem pozostawić do całkowitego wyschnięcia, po czym preparat utrwalić (dzięki temu procesowi jest łatwiejsze wnikanie barwnika do wnętrza komórki):
fizycznie: trzykrotne przesunięcie nad płomieniem palnika;
chemicznie: poprzez użycie np. formaliny lub etanolu z domieszką eteru;
utrwalony preparat zalewać nad rynienką roztworem fioletu krystalicznego z dodatkiem 1-2% fenolu
odczekać 60 sekund do 3 minut
tryskawką delikatnie zmyć barwnik
zalać preparat jodyną lub płynem Lugola
odczekać 30 sekund do 2 minut
ostrożnie odbarwić całość w etanolu przez ok. 10-20 sekund
spłukać preparat wodą destylowaną
dobarwić innym barwnikiem, np. safraniną czy fuksyną zasadową przez ok. 30 sekund
dobrze spłukać preparat wodą destylowaną i po wyschnięciu oglądać pod mikroskopem
Mechanizm barwienia
1.Komórki bakteryjne, zarówno Gram - dodatnie, jak i Gram - ujemne, zabarwiają się fioletem krystalicznym.
2. Dodanie płynu Lugola powoduje, że fiolet reaguje z jodem, w wyniku czego tworzą się
stosunkowo duże kompleksy złożone z barwnika i jodu. Na tym etapie obydwa typy
komórek mają zabarwienie granatowe.
Płukanie w alkoholu powoduje, że w komórkach Gram-dodatnich następuje zmniejszenie
pustej przestrzeni w wielowarstwowych ścianach komórkowych, mających wygląd wielu (ok. 50) nałożonych na siebie siatek. W rezultacie kompleksy fioletu krystalicznego z jodem nie mogą ulec wypłukaniu, co w przypadku 1-2 warstw u bakterii Gram-ujemnych nie jest przeszkodą i alkohol świetnie wypłukuje barwnik. Możliwe też, że kompleks fiolet-jod łączy się trwale z kompleksem rybonukleinianu magnezu (niedobór magnezu może powodować barwienie na czerwono bakterii zasadniczo Gram-dodatnich) i zasadowego białka, które są obecne w ścianie bakterii Gram-dodatnich w dużych ilościach lub bardziej ujemnie naładowana (inny punkt izoelektryczny) ściana Gram-dodatnich silniej wiąże zasadowy fiolet.
Po zakończonym płukaniu komórki Gram-dodatnie są granatowe, zaś Gram-ujemne - bezbarwne.
5.Dodatkowy barwnik (np. safranina, fuksyna) dobarwia, niezbyt mocno, komórki Gram-ujemne, nie zmieniając barwy komórek Gram-dodatnich.
Efekt barwienia metodą Grama
W efekcie wyżej przedstawionych działań i opisanego mechanizmu komórki efekty mogą być trojakie:
bakterie barwiące się na kolor ciemnofioletowy, prawie czarny, określamy jako gram - dodatnie lub (Gram +),
bakterie odbarwiające się pod wpływem etanolu z koloru ciemnofioletowego na kolor czerwony, określamy jako Gram - ujemne lub (Gram -),
bakterie nie barwią się standardową metodą Grama, np. prątki (są trudnobarwliwe - można je wybarwić poprzez wydłużenie czasu dla fioletu krystalicznego i płynu Lugola),
bakterie Gram-zmienne, np. Gardnella vaginalis
Efekt barwienia zależy od podłoża i wieku hodowli:
starsze hodowle Clostridium mogą barwić się Gram - ujemnie
kiełkujące endospory (i pierwsze pokolenie po wykiełkowaniu) Bacillus subtilis barwią się Gram-ujemnie.
Barwienie metodą Ziehla-Neelsena - w bakteriologii i rodzaj techniki diagnostycznej służącej do odróżniania bakterii kwasoodpornych i niekwasoopornych (diagnostyka gruźlicy).
Wykonanie
na utrwalony rozmaz bakterii na odtłuszczonym szkiełku podstawowym nanosimy barwnik podstawowy (stężona fuksyna karbolowa) na 15 min. W trakcie barwienia podgrzewamy preparat palnikiem (do tzw. "trzech par")
zlewamy barwnik. Nie spłukujemy wodą destylowaną
odbarwiamy preparat w 3% roztworze HCl w etanolu (kwaśny alkohol)
spłukujemy wodą destylowaną
nanosimy barwnik kontrastowy, np. Błękit metylenowy na 10 min.
spłukujemy wodą destylowaną
suszymy preparat na pasku bibuły i przeprowadzamy obserwacje w mikroskopie świetlnym z zastosowaniem imersji
Wynik
W wyniku takiego postępowania bakterie kwasooporne przybierają kolor czerwony pochodzący od fuksyny (nie odbarwiają się one bowiem w kwaśnym alkoholu). Natomiast bakterie niekwasoodporne są wrażliwe na działanie kwaśnego alkoholu, odbarwiają się w nim z fuksyny i mają kolor niebieski od błękitu metylenowego.
Metodą tą można też barwić zarodniki grzybów i przetrwalniki bakterii.
Barwienie metodą Schaeffera-Fultona - metoda polegająca na identyfikacji bakterii zaliczanych do grupy Bacillus i Clostridium, a przede wszystkim przetrwalników tych bakterii, ich kształtu i rozmieszczenia.
Etapy barwienia
Wykonujemy posiew bakterii na szkiełku podstawowym i utrwalamy (najczęściej w płomieniu),
Przemywamy zielenią malachitową (barwnik),
Ponieważ przetrwalniki mają wiele warstw ochronnych, należy podgrzać preparaty aby komórki się zabarwiły,
Należy podgrzewać preparaty tak długo, aż zaczną one parować, wtedy przetrwalnik rozluźniają swoje otoczki i barwnik może do nich wniknąć,
Czekamy aż preparaty wystygną - w czasie tego procesu przetrwalniki zamykają swoje otoczki i barwnik pozostaje wewnątrz,
Płuczemy preparaty - zabarwione są tylko przetrwalniki, reszta komórek - nie,
Aby zabarwić pozostałą część komórek, używamy safraniny.