Mikrobiologia

Wybrane metody barwienia

Dr n. biol. Henryk Różański

Laboratorium Biologii Przemysłowej i Eksperymentalnej

Państwowa Wyższa Szkoła Zawodowa w Krośnie

Barwienie złożone

• Barwienie złożone pozwala na wyraźniejsze

zróżnicowanie właściwości biologicznych
bakterii.

• Polega na zastosowaniu kilku barwników.
• Metoda Grama
• Metoda Ziehla-Neelsena
• Metoda Neissera
• Metoda Giemsy

Metoda Grama

• Pozwala podzielić bakterie na dwie

zasadnicze grupy: Gram-dodatnie i Gram-
ujemne.

• Odmienne barwienie się bakterii metodą

Grama związane jest ściśle z różnicami w
budowie chemicznej.

Hans Christian Joachim Gram

1852-1938

• Duński botanik, lekarz.
• Metoda barwienia 1884 r.

Hans Christian Joachim Gram, 1852-1938.

Metoda Grama – technika barwienia

• Utrwalony preparat traktować odczynnikami wg

kolejności:

- fiolet krystaliczny 2-3 minuty,
- płyn Lugola 1-2 minuty,
- alkohol aż do odbarwienia ok. 30 sekund,
- woda – spłukanie,
- Fuksyna w roztworze fenolowym (rozc. 1:10) 20

sekund,

- Woda – spłukanie.

Metoda Grama

• Pod wpływem fioletu krystalicznego i płynu

Lugola w niektórych drobnoustrojach powstają
związki chemiczne (kompleksowe)
nierozpuszczalne w alkoholu.

Bakterie takie mimo działania alkoholu pozostają
zabarwione na kolor fioletowy  bakterie Gram-
dodatnie (Gram+).
Inne bakterie odbarwiają się pod wpływem
alkoholu, dobarwione fuksyną barwią się na kolor
czerwony  bakterie Gram-ujemne (Gram-).

Gram Positive Bacteria (Cocci)

http://www.sciencephoto.com/media/80940/enlarge

http://www.medschool.lsuhsc.edu/microbiology/DMIP/dmex17.htm

http://faculty.cbu.ca/cglogowski/2008%20BIOL101LAB2.htm

Gram positive (purple) & Gram negative (pink) bacteria

Metoda Ziehla-Neelsena

• Rozróżnia bakterie kwasooporne i niekwasooporne.
• Kwasooporność jest cechą gatunkową niektórych

bakterii (prątek gruźlicy, niektóre promieniowce).

• Zależy to od składu chemicznego cytoplazmy

bakterii.

• Odgrywa ważną rolę w diagnostyce gruźlicy.
• Prątki gruźlicy ze względu na dużą zawartość

związków lipidowych nie barwią się metodami
zwykłymi.

• Metoda Ziehla-Neelsena służy również do barwienia

zarodników.

Franz H. Ziehl 1857-1926,

niemiecki bakteriolog

• Friedrich Carl

Adolf Neelsen
1854-1898,
niemiecki
patolog

http://www.spcollege.edu/hec/vt/vtde/ate2639lgs/gramstain.htm

http://pathtalk.org/archives/22

http://www.khdf.de/cms/index.
php?id=194&site=www&lang=d
e

Metoda Ziehla-Neelsena – technika

barwienia

• Postępowanie wg kolejności:
- potraktować preparat fuksyną fenolową, następnie

ogrzewać preparat płomieniem palnika do 1 pary, barwić

przez 2-3 minuty;

- Po ostudzeniu, zlać barwnik i spłukać preparat wodą;
- Odbarwić alkoholem kwaśnym;
- Spłukać wodą
- Dobarwić rozcieńczonym błękitem metylenowym przez 1-

2 minuty;

- Spłukać wodą;
- Wysuszyć;
- Obserwować obiektywem metoda immersji.
• Bakterie kwasooporne, np. prątek gruźlicy są zabarwione

na czerwono, tło jest niebieskie.

Metoda Neissera

• Uwyraźnia charakterystyczne dla

maczugowców błonicy ziarenka wolutyny

• Maczugowce błonicy zostają zabarwione na

kolor żółty, a ziarenka wolutyny na fioletowo

http://de.wikibooks.7val.com/wiki/Medizinische_Mikrobiologie:_Grampositive_St%C3%A4bchen

• dwoinka rzeżączki

(Neisseria
gonorrhoeae)
zwana gonokokiem
(1879 r.)

Albert Neisser 1885-1916

Metoda Neissera – technika barwienia

• Przed barwieniem zmieszać 2 części odczynnka I

(błękit metylenowy 1 g, alkohol absolutny 20 ml,

kwas octowy lodowaty 50 ml, woda destylowana

– do 1000 ml) z 1 częścią odczynnika II (fiolet

krystaliczny 1 g, alkohol absolutny 10 ml, woda

destylowana do 300 ml).

• Utrwalony preparat barwi się mieszaniną 5 minut.
• Po zlaniu barwnika preparat potraktować

odczynnikiem III (chryzoidyna 10 g, woda

destylowana 300 ml) w ciągu 15 sekund, potem

spłukać wodą.