Materiał do badań na beztlenowce:
- płyny ustrojowe inne niż mocz, wysięki z ropni głębokich, zawartość wyrostka robaczkowego, biopsje z tkanek, wysięki z kieszonek dziąsłowych, z kanałów korzeniowych, jeśli pobieramy z krwi to tylko z żyły
Podłoża służące do hodowli beztlenowców:
Bulion Tioglikolanowy - płynny, półpłynny (cysteina, tioglikolan sodu, hemina, witamina K, 0,1% rezazuryna jako wskażnik utlenienia pożywki (w warunkach beztlenowych jest czerwona, a tlenowa jest różowa)
Podłoże Wrzoska - płynne, kawałek wątroby która pochłania tlen, na wierzchu warstwa płynnej parafiny
Przygotowane metoddą Pras - pepton, glukoza, mandion, hemina, wyciąg drożdżowy inne.
Agar wybiórczy - stałe, (zieleń brylantowa lub żółć, mogą być antybiotyki - wankomycyna, neomycyna, streptomycyna
Agar wzbogacony - z krwią lub z heminą lub menadionem
Agar o wysokim słupie - ¾ próbówki z agarem, im głebiej tym bardziej beztlenowe
Podłożatransportowe:
sładniki obniżające potencjał oksydoredukcyjny
sole mineralne
agar lub żelatyna do zestalenia
Z podłoża transportowego robię preparat Gramma i posiew na podłożu stałym.
Skłądniki obniżające pot.oksydoredukcyjny: cysteina, cystyna, wit.C, tioglikolan sodu, kwas tioglikolanowy
Czynniki wzrostowe: pepton, glukoza, witamina C, hemina, menadion
Czynnik zapobiegający krzepnięciu: SPS - sól sodowa polianytolosulfonianu
Posiew na AKB + krew:
- izolacyjno - redukcyjny
- następnie wkładamy płytkę do anaerostatu monometrowego agarem do dołu - zawsze!! - w anaerostacie zaworowym w którym mamy ciśnienie
- dodajemy żel krzemionkowy lub CaCl3 jako odsuszacz
- dodajemy katalizator palladowy w siateczce miedzianej
- inaktywujemy katalizator i odsuszacz przez 2h w 160 C
- dodajemy wskażnik (bibułka z błękitem metylenowym w warunkach tlenowych będzie niebieska, a w beztlenowych biała; inaktywacja przez zwilżenie wodą destylowaną)
- zamykamy szczelnie anaerostat i podłączamy pod pompę próżniową
- przeprowadzamy trzykrotną wymianę gazową (wpuszczamy odtleniony azot poprzez filtr miedziany)
- całość wypełniamy specjalną mieszaniną gazów (10% CO2, 10% H2, 80% N2)
- do zaworu podlączamy balonik z wodorem na 0,5h
- anaerostat wstawiamy do cieplarki
W anaerostacie bez monometrowym = bezpróżniowym dodajemy specjalny GAS-PACK inaktywowany po dodaniu 10ml wody destylowanej
GENER-BAG - jednorazowa wersja anaerostatu
Metoda komorowa - specjalna komora wypełniona CO2 lub odtlenionym azotem. Posiew robimy ezą elektryczną.
Metoda Fornera - agar AKB dzielimy na częsci (1/3 wysiewamy beztlenowce, a na pozostałej części tlenowce które po szczelnym zamknięciu płytki zużyją nam tlen w niej zawarty
Odczyt:
Hodowla trwa 1-2 tygodnie (w przypadkach zagrożenia życia - 4 dni)
Przesiewamy materiał na bulion tioglikolanowy
Robimy preparat metodą Gramma
Opisujemy typ Hemolizy
Sprawdzamy czy bakterie świecą w lampie HBO 200
Możemy wykonać test na identyfikację bakteri beztlenowych:
Metoda mikropróbówkowa (robimyzawiesinę bakteri w 0,9% NaCl, nastepnie za pomocą pipety zawiesinę umieszczamy w mikropróbówkach i porównujemy kolory ze wzorcem.
Metoda chromatograficzna: badamy wytwarzanie kwasów tłuszczowych (mrówkowy, octowy, masłowy, propionowy, maleinowy, kapronowy)
Badanie otoczek metodą Manevalla:
Pobieramy ezą bakterie z AK i robimy zawiesinę w 0,9% NaCl, następnie na odtłuszczone szkiełko nanosimy dwie krople czerwieni Kongo, dodajemy ezą zawiesinę bakteri i mieszamy z czerwienią, czekamy aż wyschnie, zalewamy odczynnikiem Manevalla na 1 min, zlewamy barwnik i czekamy aż wyschnie - jest to metoda barwienia pozytywno - negatywna (tło jest niebieskie, komórki różowe a otoczki niewybarwiają się)