ĆWICZENIE NR 1
AMINOKWASY
Data wykonania ćwiczenia: 08.10.2008
Data oddania sprawozdania: 15.10.2008
28.10.2008
Wprowadzenie
Aminokwasy są małocząsteczkowymi związkami organicznymi. Są to podstawowe jednostki strukturalne białek. Aminokwas jest zbudowany z grupy karboksylowej, grupy aminowej, atomu wodoru oraz charakterystycznej grupy R, które wiążą się kowalencyjnie z atomem węgla, określanym jako węgiel alfa. Węgiel ten u wszystkich aminokwasów (poza glicyną) jest atomem chiralnym. Grupa R nazywana jest łańcuchem bocznym aminokwasu.
Właściwości chemiczne rodnika R systematyzują aminokwasy w cztery grupy:
- aminokwasy apolarne (np. glicyna, alanina)
- aminokwasy polarne lecz nie zjonizowane (np. cysteina, tyrozyna)
- aminokwasy „kwasowe” (np. asparagina, glutamina)
- aminokwasy „zasadowe” (np. lizyna, arginina)
W roztworze o pH obojętnym aminokwasy występują zasadniczo w formie zjonizowanej, jako jony obojnacze. Aminokwas w postaci jonu obojnaczego ma protonowaną grupę aminową - NH3+ oraz zjonizowaną grupę karboksylową -COO- (tzw. amfijon - forma jonu obojnaczego przy pH równym punktowi izoelektrycznemu). Ze zmianami pH roztworu zmienia się stan jonizacji cząsteczki aminokwasu (pH < pI - forma kationowa,
pH > pI - forma anionowa). W punkcie izoelektrycznym aminokwasy wykazują najsłabszą rozpuszczalność oraz posiadają najmniejsze przewodnictwo elektryczne. Punkt izoelektryczny dla każdego aminokwasu jest inny.
Aminokwasy są związkami amfoterycznymi. Oznacza to, że ulegają reakcjom charakterystycznym dla grupy aminowej i grupy karboksylowej. Aminokwasy spełniają ten warunek dzięki jednoczesnej obecności w cząsteczce protonodawców i protonobiorców.
Podstawową funkcja biologiczną aminokwasów jest udział w tworzeniu białek. Są to tzw. aminokwasy proteinogenne.
Cel ćwiczenia
Celem ćwiczenia jest wykazanie amfoterycznego charakteru aminokwasów oraz zapoznanie z metodami analizy tych związków.
Część doświadczalna
Amfoteryczne właściwości aminokwasów:
Sposób wykonania: szczyptę krystalicznej L-tyrozyny rozpuściłam na ciepło, w łaźni wodnej, w kilkunastu kroplach roztworu HCl. Ochłodziłam i dodałam kropla po kropli roztwór NaOH, aż do momentu powstania wyraźnego osadu. Następnie zalkalizowałam, używając mocniejszego roztworu zasady.
Obserwacje: po dodaniu do mieszaniny roztworu NaOH utworzył się biały, kłaczkowaty osad, który rozpuścił się po zalkalizowaniu mocniejszym roztworem zasady.
Wnioski: Aminokwasy mają charakter amfoteryczny. Zjawisko to można obserwować, zmieniając pH roztworu aminokwasu. Za tę właściwość odpowiadają ugrupowania
COO- - COOH i NH3+ NH2, które mogą przyjmować i oddawać protony. Istnieje pH, w którym ilość ładunków dodatnich równa jest ilości ładunków ujemnych. Takie pH nazywa się pI - punktem izoelektrycznym. Aminokwas występuje w tym punkcie w postaci jonu obojnaczego i wykazuje najsłabszą rozpuszczalność. Właśnie dlatego, gdy dodałam do mieszaniny roztwór NaOH pojawił się biały osad. Dodając zasadę zmieniłam wcześniej utworzone środowisko kwasowe aż do uzyskania pH = pI L-tyrozyny. Dodając dalej mocniejszego roztworu zasady osad rozpuścił się, ponieważ zmieniłam pH (pH>pI)
+H3N-CHR-COOH +H3N-CHR-COO- H2N-CHR-COO-
kation jon obojnaczy anion
środowisko kwasowe pI środowisko zasadowe
Metody ogólne oznaczania aminokwasów
Odczyn ninhydrynowy:
Reakcji tej ulegają aminokwasy z wolną grupą α aminową, czyli wszystkie aminokwasy proteinogenne (z wyjątkiem proliny).
Sposób wykonania: do 0,5 ml roztworu badanego aminokwasu (glicyna, tyrozyna i histydyna) dodałam 0,5 ml odczynnika ninhydrynowego. Mieszaninę ogrzewałam przez 15 minut we wrzącej łaźni wodnej (100oC). Wykonałam również próbę odczynnikową - zamiast aminokwasu zawierała wodę oraz próbę z roztworem białka jaja kurzego.
Obserwacje: mieszaniny zawierające białko, glicynę i histydynę zabarwiły się na kolor ciemnogranatowy, mieszanina z tyrozyną - kolor herbaciany, natomiast mieszanina z wodą pozostała bezbarwna.
Wnioski: Zaszła reakcja, którą obrazuje poniższy wzór ogólny:
W pierwszym etapie powyższej reakcji cząsteczka aminokwasu pod wpływem ninhydryny ulega utlenieniu i przekształca się w aldehyd uboższy o jeden atom węgla. Formą przejściową między aminokwasem a aldehydem jest iminokwas (iminokwas ulega dekarboksylacji i tworzy się aldehyd). Aldehyd ulega deaminacji, wydziela się CO2 i NH3. Następnie w wyniku kondensacji , za pośrednictwem cząsteczek amoniaku, zredukowanej i utlenionej formy ninhydryny tworzy się barwny kompleks. Intensywność zabarwienia próby jest wprost proporcjonalna do ilości uwolnionego amoniaku, a w konsekwencji do zawartości aminokwasu w próbie.
Ninhydryna jest odczynnikiem stosowanym do wykrywania aminokwasów, ponieważ reakcji z ninhydryną ulegają aminokwasy z wolną grupą alfa aminową, czyli wszystkie (z wyjątkiem proliny).
Po przeprowadzeniu powyższej reakcji jedynie w próbie z wodą nie zaobserwowałam barwnego produktu. Takie obserwacje potwierdziły, że w pozostałych próbach znajdowały się aminokwasy.
Reakcja z kwasem azotawym (wg. Van Slyke'a):
Sposób wykonania: Do 2 ml roztworu NaNO2 dodałam 2 ml roztworu CH3COOH. Dokładnie wymieszałam i dodałam 2,5 ml badanego aminokwasu (glicyna i tryptofan).
Wykonałam również próbę kontrolną, w której zamiast aminokwasu była woda oraz próbę z roztworem białka jaja kurzego.
Obserwacje: w probówkach z aminokwasami i białkiem powstały pęcherzyki gazu. Mieszanina zawierająca glicynę pozostała bezbarwna, natomiast mieszanina z tryptofanem zrobiła się lekko żółta. W probówce, w której znajdowała się woda nie zaobserwowałam żadnych zmian.
Wnioski: Zaszła reakcja, którą obrazuje poniższy wzór ogólny:
Pęcherzyki gazu w probówkach z aminokwasami i białkiem powstały na skutek wydzielającego się gazowego azotu (kwas azotawy wywołuje deaminację aminokwasów z wydzieleniem stechiometrycznej ilości gazowego azotu).
Jest to kolejna metoda pozwalająca wykryć obecność aminokwasów.
Metody wybiórcze
Reakcja ksantoproteinowa:
Sposób wykonania: do 1 ml roztworu aminokwasu (badałam tryptofan, tyrozynę i glicynę) dodałam 0,5 ml stężonego HNO3 i ogrzałam próbę we wrzącej łaźni wodnej (ok. 30 sekund). Następnie ochłodziłam mieszaninę i zalkalizowałam za pomocą 2-3 ml roztworu NaOH. To samo wykonałam dla wody i białka.
Obserwacje: w probówkach, w których znajdowały się tryptofan i tyrozyna mieszaniny zabarwiły się na kolor herbaciany. W probówce z białkiem zaobserwowałam żółte zabarwienie oraz lekki pomarańczowy osad. Mieszaniny zawierające wodę i glicynę pozostały bezbarwne.
Wnioski: Podczas ogrzewania aminokwasów aromatycznych ze stężonym kwasem azotowym pierścień aromatyczny ich łańcucha bocznego ulega nitrowaniu. Powstałe nitrowe pochodne wykazują w środowisku zasadowym intensywne żółtopomarańczowe zabarwienie.
Np.:
Za pomocą reakcji ksantoproteinowej można wykryć aminokwasy aromatyczne. Reakcja ksanotoproteinowa udowodniła, że tyrozyna i tryptofan zawierają pierścień aromatyczny w swoich cząsteczkach, natomiast glicyna nie zawiera.
Reakcja Millon'a (tylko dla tyrozyny):
Sposób wykonania: do 0,5 ml roztworu tyrozyny dodałam 0,5 ml odczynnika Millon'a. Ogrzałam we wrzącej łaźni wodnej. Wykonałam również próbę z białkiem i wodą.
Obserwacje: W probówkach zawierających białko i tyrozynę powstał ceglastoczerwony produkt. W probówce z białkiem produkt był dużo bledszy. Próba z wodą nie wykazała żadnych zmian.
Wnioski: Zaszła poniższa reakcja:
Reakcja nitrowania tyrozyny przebiega w obecności jonów rtęci. Powoduje to powstawanie soli rtęciowej jej nitrowej pochodnej, która ma ceglastoczerwone zabarwienie. Uzyskując taki kolor produktu potwierdziłam zawartość tyrozyny w badanej próbie.
Reakcje charakterystyczne dla tryptofanu:
a) odczyn aldehydowy wg. Rosenheim'a
Sposób wykonania: do 1 ml roztworu tryptofanu dodałam 3-4 krople roztworu aldehydu mrówkowego, 1 ml stężonego kwasu siarkowego oraz 2-4 krople nasyconego roztworu siarczanu rtęci. Całość dokładnie wymieszałam. To samo wykonałam dla białka i wody.
Obserwacje: mieszaniny z tryptofanem i białkiem zyskały ciemnobrunatne zabarwienie (w probówce z białkiem zabarwienie produktu mniej intensywne niż w probówce z tryptofanem). W próbie z wodą nie zaobserwowałam zmiany zabarwienia.
b) reakcja wg. Adamkiewicza - Hopkins'a (dla tryptofanu):
Sposób wykonania: do 1 ml roztworu tryptofanu/białka/wody dodałam 1 ml roztworu kwasu glioksalowego. Wymieszałam i po ściance probówki dodałam 1 ml stężonego kwasu siarkowego.
Obserwacje: W przypadku białka i tryptofanu utworzyły się dwie warstwy rozdzielone grubą, fioletową obrączką.
Wnioski: Wnioski: Zaszła reakcja:
W obecności czynnika utleniającego pierścień indolowy tworzy barwne produkty kondensacji, powstające za pośrednictwem reszty aldehydu mrówkowego lub kwasu glioksalowego. Uzyskane przeze mnie ciemnobrunatne zabarwienie produktu kondensacji (odczyn aldehydowy wg. Rosenheima) oraz fioletowa obrączka (reakcja wg. Adamkiewicza-Hopkins'a) potwierdza, że jest to tryptofan. Metody te pozwalają wykryć ten aminokwas.
0
Odczyn Pauly'ego (dla histydyny):
Sposób wykonania: do 1 ml roztworu aminokwasu/białka/wody dodałam 2 ml roztworu kwasu sulfanilowego oraz 1 ml roztworu azotynu sodu. Następnie wymieszałam i dodałam 1 ml roztworu wodorotlenku sodowego.
Obserwacje: utworzony produkt ma czerwone zabarwienie. W przypadku próby
z wodą - brak zabarwienia.
Wnioski: Diazozwiązek (wytworzony z kwasu sulfanilowego) w wyniku sprzęgania ze składową azową, którą stanowi reszta histydyny (zawierająca silnie zasadowy pierścień imidazolowy) tworzy barwną pochodną diazową o intensywnie czerwonym zabarwieniu.
Reakcja cystynowa:
Sposób wykonania: szczyptę cysteiny rozpuściłam w ok. 0,5 ml wody. Dodałam kilka kropli roztworu octanu ołowianego i 1 ml roztworu NaOH i umieściłam we wrzącej łaźni wodnej. To samo wykonałam dla białka i wody.
Obserwacje: po pewnym czasie (ok.25-30 minut) pojawił się szaro-czarny osad. Tylko w próbie z wodą nie zaobserwowałam zmian.
Wnioski: obecna w cystynie siarka została uwolniona i występuje w roztworze w postaci jonów siarczkowych. Powstały osad to siarczek ołowiany, który powstał po dodaniu do próby jonów ołowiawych.
Zadania
Katarzyna Syka:
Jako pierwszą przeprowadziłam reakcję z odczynnikiem ninhydrynowym. Zaobserwowałam kolor herbaciany, co oznaczało, że w mojej probówce znajduje się aminokwas. Następnie przeprowadziłam reakcję ksantoproteinową. Mieszanina uzyskała kolor brunatny, czyli badany aminokwas jest aromatyczny. Jako kolejną wykonałam reakcję Millon'a charakterystyczną dla tyrozyny. Powstał żółty produkt. Pozwoliło mi to wykluczyć ten aminokwas. Ostatnią wykonana przeze mnie reakcją była reakcja wg. Rosenheim'a. Powstał ciemnobrunatny produkt. Na podstawie powyższych reakcji wywnioskowałam, że badanym aminokwasem jest tryptofan.
Beata Szymczak:
Dla ustalenia jaki aminokwas zawiera próbka, przeprowadzam reakcję z odczynnikiem ninhydrynowym. Po dodaniu odczynnika do próbki uzyskuję błękitny odcień a po ogrzaniu barwa staje się ciemnogranatowa. Wskazuje to na obecność w próbce aminokwasu: glicyny lub histydyny.
Przeprowadzam reakcję ksantoproteinową. Po dodaniu stężonego kwasu azotowego (V) do aminokwasu, roztwór pozostaje bezbarwny, a po zalkalizowaniu zabarwia się na jasnożółty. Reakcja ta pozwala wykluczyć aminokwasy aromatyczne.
Przeprowadzam reakcję z odczynem Pauly'ego dla histydyny. Po dodaniu do próbki odczynników, uzyskuję jasnożółty odcień. Oznacza to, że aminokwas nie posiada pierścienia imidazolowego i tym samym wykluczam obecność histydyny w próbce.
WNIOSEK: Próbka zawiera glicynę.
Wnioski ogólne
Wnioski dotyczące poszczególnych reakcji zostały przedstawione w części doświadczalnej.
Do metod ogólnych wykrywania aminokwasów należą reakcje z odczynnikiem ninhydrynowym oraz z kwasem azotawym. Odczyn ninhydrynowy pozwala również stwierdzić jakie jest stężenie aminokwasu w badanej próbie (intensywność zabarwienia produktu).
Metody wybiórcze oparte są na charakterystycznych reakcjach łańcuchów bocznych aminokwasów.
2