5.1. Oznaczanie glukozy metodą Somogyi-Nelsona

Cel: Kolorymetryczne oznaczenie poziomu cukru we krwi.

Postępowanie:

• Przygotowano 11 probówek do sporządzenia krzywej wzorcowej, do pierwszej dodano 0,5μl wody - próba ślepa odczynnikowa, a do reszty dodano odpowiednią ilość roztworu glukozy o stężeniu 200μg/ml i dopełniono daną ilością wody (do końcowej objętości próby 500μl

Nr próbki	Ilość roztworu glukozy	Objętość wody
1.1	50 μl	450 μl
1.2	50 μl	450 μl
2.1	100 μl	400 μl
2.2	100 μl	400 μl
3.1	200 μl	300 μl
3.2	200 μl	300 μl
4.1	300 μl	200 μl
4.2	300 μl	200 μl
5.1	400 μl	100 μl
5.2	400 μl	100 μl

• Przygotowano próbkę badanej surowicy -> 1) próbkę odbiałczano dodając : 750 μl H₂O₂ , 200 μl 5% ZnSO₄, 200 μl 0,35M Ba(OH)₂, następnie przygotowano próbę ślepą gdzie zamiast surowicy umieszczono wodę.

• Próbkę badaną wykonano w dwóch powtórzeniach

• Próbki - badane oraz ślepą odczynnikową odwirowano w wirówce przez 3 min przy obrotach 14 000obr./min.

• Po odwirowaniu zebrano po 0,5 ml odbiałczanego roztworu surowicy do dwóch probówek (oraz 0,5ml nadsączu próby ślepej)

• Do wszystkich 11 probówek krzywej wzorcowej oraz 3 próbek badanych dodano po 0,5ml odczynnika miedziowego i ogrzewano w łaźni wodnej przez 15 min

• Po ochłodzeniu zawartości probówek dodano do wszystkich roztworów po 0,5ml odczynnika arseno-molibdenowego oraz po 3,5ml wody

• Zmierzono absorbancję prób przy długości fali λ=520nm (względem próby ślepej)

• Obliczono stężenie glukozy we wszystkich próbach krzywej wzorcowej w następujący sposób:

200 μg glukozy znajduje się w 1ml czyli 200 μg jest w 1000 μl, więc ile jest glukozy kolejno w 50, 100, 200, 300 i 400 μl?

200 μg - 1000 μl

X - 50 μl

X= 10 μg

Mamy więc 10 μg glukozy w 50 μl dodanych do 450 μl wody czyli mamy 10 μg w 500 μl, więc:

10 μg - 500 μl

X - 1000 μl

X= 20 μg/ml

Analogicznie wykonano obliczenia dla pozostałych roztworów i otrzymano wyniki:

Roztwór gdzie dodano 100 μl glukozy ma końcowe stężenie 40 μg/ml, 200 μl - 80 μg/ml,

300 μl- 160 μg/ml, 400 μl - 320 μg/ml.

• Otrzymane dane pomiaru absorbancji umieszczono w tabeli:

Próba	Stężenie glukozy [μg/ml]	Absorbancja	średnia	Ilość glukozy [μg]
Badana 1	x	0,121	0,1305
Badana 2	x	0,140
1.1	20	0,101		0,111
1.2	20	0,121
2.1	40	0,236		0,217
2.2	40	0,198
3.1	80	0,352		0,362
3.2	80	0,372
4.1	160	0,569		0,585
4.2	160	0,609
5.1	320	0,808		0,784
5.2	320	0,760

Tabela 2. wartość absorbancji w zależności od stężenia glukozy w roztworze.




Dla wartości absorbancji obliczono odchylenie standardowe ze wzoru :

σ = Σ_A/N-1

σ = 0,457667

Z wykresu 1. wynika, że w badanej próbie ilość cukru wahała się od 10-18 mikrogramów. Wiedząc, że w surowicy zdrowego człowieka ilość glukozy waha się w granicach 3,6-6,1mM, możemy obliczyć:

Masa cząsteczkowa glukozy = 180 g/mol = 180 000 000 μg

1mol - 180g

1000mM - 180 000 000

Więc:

1000 mM - 180 000 000

X - 18 μg

X =

Lub

x mM- 10 μg

To x =

---