Wykład z chemii klinicznej 19 kwietnia 2010

Serum protein electroforesis (SPE PARAGON)

ZMIANY PATOLOGICZNE W RZDZIAŁACH ELEKTROFORETYCZNYCH

Hipoproteinemia:

1. występuje w stanach niedożywienia i w stanach nieselektywnej utraty białka

2. cechuje ją obniżenie stężenia białka całkowitego

3. procentowa zawartość poszczególnych frakcji pozostaje prawidłowa

Utrata białka przez kłębki nerkowe:

1. uszkodzenie kłębków nerkowych powoduje utratę w pierwszym rzędzie białek o masie cząsteczkowej poniżej 100 000, tj. albuminy i transferyny, powodując hipoalbuminemię i hipoproteinemię

2. przy większych uszkodzeniach kłębków dochodzi do utraty IgG i IgA z moczem, a w konsekwencji do hipogammaglobulinemii

Niedobór żelaza

1. w niedokrwistości z niedoboru żelaza zwiększenie stężenia transferyny może powodować izolowane podwyższenie frakcji beta-globulin

Anemia hemolityczna

1. przewlekła lub ostra hemoliza, najczęściej typu autoimmunizacyjnego, może powodować obniżenie frakcji alfa₂ wskutek zużycia haptoglobiny

Przewlekłe zapalenia

1. znaczne poliklonalne zwiększenie stężenia immunoglobulin, co daje rozlany wzrost frakcji globulinowej oraz zmiany charakterystyczne dla obrazu ostrej fazy

Gammapatia poliklonalna

1. nadprodukcja immunoglobulin kilku klas daje rozlany wzrost frakcji gamma-globulin

Gammapatia monoklonalna

1. jeden rodzaj cząstek immunoglobulin produkowany przez patologiczny klon limfocytó B lub plazmocytów powoduje obecność w proteinogramie ostro odgraniczonego pasma zwanego gradientem M

Immunofiksacja:

1. immunofiksacja jest techniką immunoelektroforetyczną, mającą najszersze zastosowanie głównie przy wykrywaniu gammapatii monoklonalnych

2. metoda do identyfikacji klasy przeciwciał monoklonalnych

3. polega na przeprowadzeniu sześciu równoległych rozdziałów elektroforetycznych

4. przy zastosowaniu szablonu na pierwszy z wykonanych rozdziałów nakłada się przeciwciała przeciwko wszystkim białkom surowicy

5. na pozostałe ścieżki elektroforetyczne nakłada się przeciwciała przeciwko immunoglobulinom klasy IgG, IgA, IgM, łańcuchom lekkim kappa i lambda

6. w wyniku immunoprecypitacji białek surowicy z zastosowanymi przeciwciałami możliwa jest identyfikacja klasy immunoglobuliny monoklonalnej i związanego z nią typu łańcucha lekkiego

Nowoczesne metody oznaczania białek

Metody immunologiczne:

1. Immunonefelometria i immunoturbidymetria

1. Metody o dużej czułości

2. Do oznaczania np. białek ostrej fazy, markerów zawału mięśnia sercowego

2. immunofiksacja

1. w diagnostyce gammapatii monoklonalnych

3. ligandowi metody immunologiczne (RIA, EIA, FIA, CLIA)

1. do oznaczania np markerów nowotworowych, hormonów

4. western blotting

1. do oznaczania np. markerów nowotworowych

5. aglutynacja lateksowa

1. do oznaczania np. CRP

6. immunochromatografia

1. do oznaczania np. hemoglobiny glikowanej

Inne metody:

7. metody receptorowe

8. proteomika

Blotting:

1. elektroforeza na żelu

2. blotting (transfer)- przeniesienie frakcji z żelu na akrusz folii (nylonowe)

1. transfer fragmentów DNA (southern blotting)

2. transfer RNA (northern blotting)

3. transfer białek (western blotting)

4. transfer białek po elektroforezie dwukierunkowej (eastern blotting)

3. wiązanie materiału z folią

4. detekcja

1. autoradiografia (przy użyciu radioaktywnych sąd)

2. Metoda chemiluminescencyjna

3. Reakcja barwna enzymu

Systematyka:

Genomika zajmuje się badaniem składu genowego (genomu) danej komórki lub organizmu.

Transkryptomika zajmuje się analizą ekspresji genów na poziomie mRNA (transkryptów)

Proteomika

Protein komplement of the geneOME (komponenta białkowa kodowana przez genom)

Dziedzina ta zajmuje się analizą proteomu, czyli całkowitego składu białkowego organizmów żywych, a w szczególności identyfikacją, … funkcji i wzajemnymi interakcjami.

Proteomika różni się od tradycyjnych metod izolacji i identyfikacji białek:

• w przypadku metod tradycyjnych izoluje się jedno białko i stara się określić jego sekwencję, strukturę i funkcję biologiczną

• proteomika zajmuje się natomiast równoczesną, globalną, analizą wszystkich białek, wykorzystując do tego wiele technik analitycznych

Największą rolę odgrywają:

• dwuwarstwowa elektroforeza

• elektroforeza kapilarna sprzężona ze spektrometrią mas (CE-MS)

• HPLC

• Dwuwymiarowa HPLC (2D-HPLC)

• Immunochromatografia

Zadania proteomiki:

Głównym celem proteomiki jest poszukiwanie markerów procesów chorobowych w nadziei na znalezienie odpowiednich leków.

Np. w onkologii: wyjaśnienie roli białek w powstawaniu nowotworów, przewidywanie wyników leczenia, wczesne wykrywanie nowotworów.

METODY STOSOWANE DO OZNACZANIA BIAŁEK OSOCZA KRWI

Białka ostrej fazy:

Mianem reakcji ostrej fazy określa się wczesny i złożony, lecz niespecyficzny odczyn organizmu na działanie różnych czynników nocyreceptywnych, takich, jak:

• zakażenia bakteryjne lub pasożytnicze

• uraz mechaniczny lub termiczny

• rozwój nowotworu

• niedokrwienie tkanek prowadzące do martwicy

• zabieg operacyjny

W przebiegu reakcji ostrej fazy występują zmiany w syntezie i stężeniu składników osocza nazywanych czynnikami ostrej fazy.

Reakcja ostrej fazy obejmuje

1. odpowiedź miejscową

2. zmiany bardziej uogólnione dotyczące funkcjonowania układu nerwowego bądź hormonalnego czy zaburzenia procesów metabolicznych

Zmiany uogólnione wyrażają się:

1. gorączką

2. leukocytozą

3. podwyższeniem OB.

4. Zmianą stężenia niektórych metali ciężkich we krwi i w wątrobie

5. Aktywacja procesów

1. Krzepnięcia

2. Fibrynolizy

3. Układu dopełniacza

4. Tworzenia kinin

5. Kaskady kwasu arachidowego

6. Towarzyszy temu

1. Ujemny bilans azotowy

2. Przeniesienie aminokwasów z mięśni do wątroby

3. Znaczne zmiany syntezy niektórych białek osocza

Następstwa umiarkowanej reakcji ostrej fazy są korzystne dla organizmu, ponieważ pomagają odzyskać zaburzoną homeostazę przez:

1. hamowanie krwawienia

2. demarkację i resorpcję zmian martwiczych

3. wiązanie i usuwanie nadmiaru proteinaz

4. przygotowanie warunków do procesów naprawy i gojenia

Reakcja immunologiczna na niekorzystne bodźce nie jest natychmiastowa. Przed wytworzeniem się swoistych przeciwciał następuje zwiększona synteza niektórych białek osocza krwi.

Białka ostrej fazy:

1. jest to grupa białek syntetyzowanych w wątrobie, których stężenie wzrasta w przebiegu stanów zapalnych, chorób zakaźnych, urazów, nowotworów i procesów martwiczych

2. białka ostrej fazy są w większości glikoproteinami i stanowią grupę heterogenną pod względem ciężaru cząsteczkowego, punktu izoelektrycznego oraz zawartości składników cukrowych

3. czynnikami aktywującymi syntezę tych białek są:

1. produkty rozpadu uszkodzonych tkanek

2. cytokiny

4. cytokiny są wytwarzane przez limfocyty pobudzone przez proces zapalny

5. zaktywowane w tych procesach makrofagi uwalniają interleukinę 1 (IL-1) i czynnik martwicy nowotworu (TNF)

6. pod wpływem TNF i IL-1 inne komórki somatyczne (komórki śródbłonka naczyń, fibroblasty) zaczyniają uwalniać cytokiny, a zwłaszcza interleukinę 6, jeden z głównych induktorów genów odpowiedzi zapalnej/immunologicznej ustroju

7. cytokiny IL-1, TNF i IL-6 indukują w hepatocytach geny białek ostrej fazy, które po uwolnieniu do krążenia stają się częścią niespecyficznej odpowiedzi immunologicznej organizmu

W syntezie białek ostrej fazy uczestniczą zasadniczo dwie grupy cytokin:

• Grupa I

• Cytokiny nazywane umownie grupą IL-1 (IL-1alfa, IL-1beta, TNFalfa) stymulują syntezę tzw. Białek I grupy, tj. CRP i SAA, natomiast hamują syntezę pozostałych białek

• Grupa II

• Cytokiny grupy IL-6 (IL-6, IL-11 i inne) pobudzają zarówno syntezę białek I grupy, jak i wszystkich pozostałych zaliczanych do drugiej grupy

Głównym miejscem syntezy białek ostrej fazy (BOF) jest wątroba, ale także monocyty, limfocyty i komórki nabłonka mogą produkować niektóre z nich.

Homeostatyczne funkcje białek ostrej fazy:

1. hamowanie proteinaz

1. makroglobuliny

2. alfa₁-antytrypsyny

3. alfa₁-antychymotrypsyny

4. Inter-alfa₁-inhibitory trypsyny

5. Alfa₁-inhibitor proteinaz cysternowych

6. haptoglobina

2. krzepnięcie i fibrynoliza

1. fibrynogen

2. alfa₂-antyplazmina

3. inaktywator C₁-esterazy

4. alfa₂-kwaśnaglikoproteina

5. białko amyloidowi P

6. białko C-reaktywne

3. usuwanie obcych cząstek z organizmu

1. białko C-reaktywne

2. białko amyloidowi A i P

3. składnik C3 układu dopełniacza

4. fibrynogen

4. modulacja odpowiedzi immunologicznej organizmu

1. inhibitory proteinaz

2. białko C-reaktywne

3. składnik C3 układu dopełniacza

4. alfa₂-HS_glikoproteina

5. alfa₁-kwaśna glikoproteina

6. fibrynogen

7. haptoglobina

5. właściwości przeciwzapalne

1. inhibitory proteinaz

2. fibrynopeptydy

3. haptoglobina

4. ceruloplazmina

6. wiązanie i transport metali oraz związków biologiczne czynnych

1. haptoglobina

2. hemopeksyna

3. transferyna

4. ceruloplazmina

5. prealbumina

6. albumina

7. makroglobuliny

8. alfa₁-kwaśna glikoproteina

Klasyfikacja białek ostrej fazy

1. bardzo silne białka ostrej fazy, których stężenie wzrasta (20-100 razy)

1. białko C-reaktywne

2. białko amyloidowe A

2. silne białka ostrej fazy, których stężenie wzrasta 2-5 razy

1. haptoglobina

2. alfa₁-antytrypsyna

3. alfa₁-kwaśna glikoproteina

4. alfa₁-antychymotrypsyna

5. alfa₁-inhibitor proteinaz cysternowych

6. fibrynogen

3. słabe białka ostrej fazy, których stężenie wzrasta o 20-60%

1. ceruloplazmina

2. składowa C3 dopełniacza

3. alfa₂-antyplazmina

4. inaktywator C₁-esterazy

4. obojętne białka osocza, których poziom nie zmienia się istotnie

1. alfa₂-makroglobulina

2. białko amyloidowe P

3. immunoglobuliny

5. ujemne białka ostrej fazy, których stężenie obniża się zwykle o 30-60%

1. albumina

2. transferyna

3. prealbumina

4. alfa₁-lipoproteina

5. alfa₂-HS-glikoproteina

Uproszczona klasufikacja:

• dodatnie białka ostrej fazy

1. białko C-reaktywne

2. alfa₁-antytrypsyna

3. alfa₁-kwaśna glikoproteina

4. haptoglobina

5. ceruloplazmina

6. fibrynogen

obojętne białka ostrej fazy

1. alfa₁-makgroglobulina

3. ujemne białka ostrej fazy

1. albumina

2. prealbumina

W zależności od kinetyki zmian pozytywne białka ostrej fazy można podzielić na białka I rzutu i białka II rzutu.

Do białek I rzutu zalicza się białka, których stężenie wzrasta już po 6-8 godzinach bodźca, osiąga wartości maksymalne po 24-48h i w przypadku usunięcia bodźca obniża się. Należą do nich:

• białko C-reaktywne

• białko amyloidowe A

• alfa₁-antychymotrypsyna

Białka II rzutu to te, których stężenie wzrasta po 24-48 h od zadziałania bodźca, osiąga poziom maksymalny po 72-96 godzinach i obniża się stosunkowo wolno. Do tej grupy należą pozostałe pozytywne białka ostrej fazy.

Wśród negatywnych białek ostrej fazy istotne znaczenie kliniczne ma albumina, której stężenie w surowicy krwi ulega obniżeniu do 3 doby po zadziałaniu bodźca nocyceptywnego.

Zmiany stężeń białek ostrej fazy są wynikiem zwiększenia lub obniżenia biosyntezy w hepatocytach. Pozawątrobowa synteza oraz zmieniony katabolizm białek odgrywają niewielką rolę.

Kinetyka zmian stężeń białek w przebiegu reakcji ostrej fazy zależy od:

• rodzaju urazu lub choroby

• poprzednich odczynów zapalnych

• indywidualnej reaktywności organizmu

Panele białek ostrej fazy:

• dla wnioskowania o przebiegu procesu zapalnego mogą być stosowane różne konstelacje trzech lub czterech białek ostrej fazy

• profile diagnostyczne często zawierają:

• jedno z silnie reagujących białek (zwykle CRP)

• dwa charakterystyczne białka średnio reagujące

• ujemnie reagującą albuminę

• taki dobór testów pozwala na ocenę

• dynamiki procesu (np. CRP)

• ogólnego katabolizmu białek osocza (np. alfa2-makroglobulina, transferyna, itp.)

• integralności łożyska naczyniowego (albumina)

Białko C-reaktywne

Wartości referencyjne <5mg/l

• jest glikoproteiną

• nazwa pochodzi od własności wiązania się z polisacharydem C pneumokoków

• CRP wiąże się z wieloma składnikami elementów strukturalnych komórek obcych (z polisacharydami bakterii) lub uszkodzonych własnych, zapoczątkowując drogę aktywacji dopełniacza

• Podobnie jak przeciwciała CRP rozpoczyna proces opsonizacji, fagocytozy i lizy obcych komórek

• Wzrost stężenia CRP następuje szybko, w ciągu 24048 h, w niektórych przypadkach zakażeń nawet wyprzedzając wystąpienie objawów klinicznych

• Po znacznym uszkodzeniu tkanek dochodzi w ciągu 6 h do wyraźnego wymiernego wzrostu stężenia CRP (20-100 krotnego)

• Maksymalne stężenie osiągane jest po 2-3 dniach (nawet 1000 x wyższe)

• Po czym w ciągu 3-4 dni następuje jego gwałtowny spadek

• U osoby zdrowej przy skaleczeniach dłoni lub stopy, lub po dużym wysiłku mogą wystąpić przejściowe wzrosty stężenia CRP do około 10 mg/l

• Zwiększenie stężenia CRP od 10 do 100 mg/l jest typowy dla lokalnych procesów zapalnych

• A od 100 do 1000 mg/l sugeruje rozległy proces zapalny

Znaczenie badania CRP:

• W praktyce klinicznej oznaczanie stężenia CRP wykorzystywane jest głównie:

• W diagnostyce chorób zapalnych oraz

• W diagnostyce różnicowej i monitorowaniu leczenia różnego rodzaju zakażeń

• Stężenie CRP wzrasta głównie w zakażeniach bakteryjnych, natomiast w infekcjach wirusowych nie zmienia się

• Stężenie CRP wzrasta na kilkanaście godzin przed wystąpieniem innych objawów zakażenia

• Białko CRP stanowi wskaźnik nieswoisty, jednak ze względu na właściwości dynamicznego reagowania jest obecnie jednym z najdoskonalszych biochemicznych markerów wielu stanów patologicznych (zapalnych, martwiczych)

• Jego ilościowe wielokrotne oznaczanie w powiązaniu z innymi badaniami klinicznymi jest przydatne w:

• Rozpoznawaniu stanów zapalnych

• Ich różnicowaniu

• Ocenie skuteczności leczenia

• W rokowaniu co do dalszego przebiegu leczenia

• Oznaczenie CRP jest najlepszym testem przesiewowym dla wykrycia rozwijającego się lub ustabilizowanego procesu zapalnego

• Sugerowano zastąpienie OB. Oznaczaniem CRP, jednakże w wielu przypadkach wzrostowi OB. Nie towarzyszy zwiększenie stężenia CRP i odwrotnie, ponieważ zmiany wartości OB. Zależą głównie od zmian w stężeniu fibrynogenu

• OB. Służy do diagnostyki stanów zapalnych, przewlekłych, a CRP- ostrych

• OB. Zależy m.in. od stężenia fibrynogenu

• OB. Wykazuje rytm dobowy, zależny m.in. od diety

• Wyniki OB. Mogą być fałszywie dodatnie (w podwyższonej temperaturze, obniżonej HCT)

• OB. Trzeba oznaczać natychmiast, CRP można w krwi mrożonej

Zalety oznaczania CRP

• Duży wzrost stężeń w porównaniu z wartościami prawidłowymi

• Nieznaczny wzrost w infekcjach wirusowych

• Normalizacja stężeń w korelacji z cofaniem się procesu bakteryjnego

• Łatwe i szybkie oznaczenie

CRP o wysokiej czułości (hsCRP)

• Białko C-reaktywne o wysokiej czułości jest wartościowym wskaźnikiem prognostycznym chorób układu krążenia o podłożu miażdżycowym

• Jest to laboratoryjne potwierdzenie znaczenia procesów zapalnych o niedużym nasileniu w patogenezie miażdżycy i w jej powikłaniach klinicznych dotyczących naczyń wieńcowych, mózgowych i tętnic obwodowych

Metody oznaczania CRP:

• immunoturbidymetria i immunonefelometria (zakres pomiarowy 3-200 mg/l)

• aglutynacyjny test lateksowy

Metody oznaczania hsCRP

• immunoturbydymetria i immunonefelometria z wysokoczułym przeciwciałem monoklonalnym i wzmocnieniem lateksowym (0,15 mg/l)

Surowicze (osoczowe) białko amyloidowe A (SAA)

Jest produkowane jako białko ostrej fazy w wielu tkankach, głównie w wątrobie. Pod wpływem mediatorów stanu zapalnego (głównie IL-1, IL-6, TNF-alfa, a w mniejszym stopniu IL-11, INF-gamma, CNF, LIF, onkostatyny M) transkrypcja mRNA dla SAA w hepatocytach wzrasta nawet 1000 x.

SAA ma wpływ

1. chemotaktyczny na neutrofile, stymuluje ich degranulację

2. na fagocytozę

3. na uwolnienie wewnątrzkomórkowych cytokin

SAA wykazuje duże podobieństwo do CRP w dynamice narastania stężeń w odpowiedzi na stan zapalny. Jest równie czułym markerem reakcji zapalnej jak CRP i posiada podobne parametry dynamiki zmian.

Jest nie tylko markerem reakcji ostrej fazy, ale również apoproteina (apoSAA), której funkcja jest związana z metabolizmem HDL. Cząsteczka taka jest szybciej usuwana z krążenia niż HDL z apoAI jako główną składową apoproteiną.

Pełni funkcję chemoatraktanta, powodując migrację monocytów do blaszki miażdżycowej. Sugeruje to możliwą rolę apoSAA w rozwoju miażdżycy.

Przewlekły lub nawracający wysoki poziom SAA jest niezbędnym, ale niewystarczającym czynnikiem rozwoju amyloidozy.

Metody oznaczania SAA:

1. immunoenzymatyczne

2. radioimmunologiczna

3. immunonefelometryczna

4. immunoturbidymetryczna

Inne białka ostrej fazy:

Alfa₁-antytrypsyna jest jednym z najsilniejszych inhibitorów proteaz- stanowi 90% aktywności antytrypsynowej osocza. W stanach zapalnych stężenie tego białka może wzrastać do 400% powyżej wartości referencyjnych, zwykle w ciągu 2-4 dni i pozostaje podwyższone do tygodnia i dłużej.

Alfa₁-kwaśna glikoproteina. W stanach zapalnych stężenie wzrasta powoli (ok. 5 dni) na ogół nie przekraczając 2-3 krotnej wartości referencyjnej. Zmiany stężenia tego białka nie powodują zmian obrazu elektroforetycznego ze względu na słabe wiązanie barwnika.

Haptoglobina. W stanach zapalnych stężenie wzrasta w ciągu 48h do wartości wielokrotnie (5-6 razy) przekraczających zakres wartości referencyjnych po czym wraca do normy po następnych 7 dniach.

Ceruloplazmina odpowiada w 80% za właściwości oksydacyjne osocza. Jest późnym białkiem ostrej fazy (3-5 dzień) wzrost stężenia 2-3 krotny. Ze względu na niskie stężenie nie wpływa na obraz elektroforetyczny.

Fibrynogen. W przebiegu stanów zapalnych po początkowy nieznacznym spadku wskutek wzmożonego zużycia, stężenie fibrynogenu wzrasta 3 x po 2-3 dniach.

Alfa₂-makroglobulina jest głównym, obok alfa₁-antyplazminy, niespecyficznym inhibitorem proteaz (np. chymotrypsyna, trypsyna, trombina, plazmina, kalikreina)

Transferyna. Białko transportujące żelazo, ujemne białko ostrej fazy.

Białka układu dopełniacza:

Jest to około 20 białek, które ulegają stopniowej aktywacji przez proteolizę. Aktywatorami są:

• kompleksy immunoglobulin IgG i IgM oraz CRP z antygenem- droga klasyczna aktywacji

• lub kompleksy IgA z mikroorganizmami- droga alternatywna

Obie drogi prowadzą do aktywacji składnika C3. stężenie tego białka jest najwyższe wśród białek tego układu. Jest wykrywane we frakcji beta₂-globulin w elektroforezie. Wzrost tego białka jest trudny do zauważenia w związku ze zwiększonym zużyciem podczas aktywacji procesu zapalnego.

Immunoglobuliny:

Tworzą heterogenną grupę białek o podobnej budowie, syntetyzowanych przez limfocyty B w odpowiedzi na przedostające się różnorodne antygeny.

Czas potrzebny do pojawienia się IgM w odpowiedzi na nieznany antygen wynosi 1-2 tygodnie. IgG powstają zwykle po paru (2-4) tygodniach w odpowiedzi na obecność w ustroju zarówno mikroorganizmów jak i cząsteczek o właściwościach antygenowych.

Metody stosowane do ilościowego oznaczania białek ostrej fazy innych niż CRP i SAA:

• immunoturbidymetria

• immunonefelometria

• metody immunochemiczne

Markery zapalenia:

• neopteryna (NPT)

• prokalcytonina (PCT)

• białko wiążące lipopolisacharydy (LBP)

Neopteryna:

• związek należący do pterydyn

• czynnikami stymulującymi syntezę i uwalnianie NPT przez makrofagi są:

• IFN-gamma

• Endotoksyny bakteryjne

• W diagnostyce laboratoryjnej wykorzystuje się oznaczanie NPT w surowicy i w moczu

• Możliwe jest oznaczanie także w:

• PMR

• Płynie otrzewnowym

• Płynie opłucnowym

• Wydzielinie z pochwy

• Zakres wartości referencyjnych NPT w surowicy 2,6-8,0 nmol/l

• Podwyższone stężenia NPT w płynach ustrojowych towarzyszą aktywacji komórkowej odpowiedzi immunologicznej

• NPT podobnie jak BOF należy do markerów nieswoistych

• Zwiększenie stężenia NPT obserwuje się bowiem zarówno w zakażeniach:

• Bakteryjnych G(+) i G(-)

• Wirusowych

• Pierwotniakowych

• Inne kliniczne wskazania do oznaczania neopteryny jako parametru immunodiagnostycznego to:

• Choroby autoimmunologiczne

• Nowotwory

• Transplantacja narządów

• Transfuzjologia

• Monitorowanie terapii immunomodulującej

• Metody oznaczania neopteryny:

• W surowicy

• ELISA

• RIA

• W moczu

• HPLC

Prokalcytonina:

• Nowy parametr budzący nowe nadzieje jako marker specyficznej, układowej odpowiedzi zapalnej na zakażenia

• Do indukcji wytwarzania PCT dochodzi przede wszystkim podczas uogólnionych reakcji zapalnych wywołanych przez zakażenia bakteryjne i grzybicze

• PCT- Swoisty marker infekcji bakteryjnych

• Jest to polipeptyd zbudowany z 116 aminokwasów o masie cząsteczkowej 13 kDA

• Czas półtrwania in vivo PCT jest zbliżony do czasu CRP i wynosi 18-30 h

• U osób zdrowych PCT wytwarzania jest przez komórki C tarczycy po procesie specyficznej wewnątrzkomórkowej proteolizy jako prohormon kalcytoniny

• Sama PCT nie wykazuje aktywności hormonalnej, jej stężenie w surowicy krwi jest niezależne od zapotrzebowania i zawartości kalcytoniny

• Tarczyca nie jest jedynym miejscem syntezy PCT, czego dowodzi wzrost jej stężenia związany z zakażeniem bakteryjnym u pacjentów po tyreidektomii

• Obecnie uważa się, że „prokalcytonina zapalna” syntetyzowana jest najprawdopodobniej w:

• Komórkach neuroendokrynnych

• Płucach

• Jelicie

• Trzustce

• Komórkach krwi obwodowej: monocytach, granulocytach, limfocytach

• Właściwości prokalcytoniny jako nowego markera laboratoryjnego

• U ludzi zdrowych w zależności od stosowanej metody górna granica wartości prawidłowych nie przekracza 0,5-0,7 ng/ml

• Lekka infekcja bakteryjna nie powoduje wzrostu PCT albo przebiega z umiarkowanie zwiększonym stężeniem PCT

• Choroby wirusowe, autoimmunologiczne, zabiegi operacyjne niepowikłane zakażeniem bakteryjnym nie powodują wzrostu jej stężenia lub wzrost ten jest tylko nieznaczny

• Stężenia PCT wykazują ścisłą korelację z ciężkością i stopniem uogólnienia infekcji bakteryjnej oraz ze stanem klinicznym pacjenta

• Włącznie do leczenia właściwego antybiotyku lub zakończona powodzeniem chirurgiczna eliminacja ogniska zapalnego powodują zmniejszenie stężenia PCT już w drugiej dobie, co jest pierwszym, wczesnym potwierdzeniem skuteczności tego leczenia

• Znaczenie diagnostyczne PCT:

• Wczesna diagnostyka infekcji bakteryjnych

• Diagnostyka różnicowa etiologii choroby, w tym różnicowanie ciężkich zakażeń bakteryjnych i wirusowych, np. ZOMR

• Kontrola skuteczności zastosowanej terapii

• Wykluczenie zakażenia u osób przygotowanych do rozległych zabiegów

• Diagnostyka różnicowa zakażeń u noworodków

• Diagnostyka i różnicowanie etiologii ostrego zapalenia trzustki

• Diagnostyka uogólnionej infekcji u dzieci z zakażeniami układu moczowego

• Metody oznaczania PCT

• Metoda immunoluminometryczna (np. LumiTEST)- metoda ilościowa

• Test półilościowy- test PCT-Q

Białko wiążące lipopolisacharydy

• Należy do białek ostrej fazy

• Mimo, że LBP podobnie jak CRP jest białkiem ostrej fazy, to jednak istnieją różnice między nimi w odpowiedzi na bodziec stymulacyjny

• CRP jest klasycznym markerem nieswoistej odpowiedzi zapalnej, natomiast stężenie LBP zwiększa się w wyniku ekspozycji na endotoksyny bakterii G(-)

• Wiąże lipopolisacharydy bakteryjne, a wytworzony kompleks LPS-LBP uczestniczy w kaskadzie zapalnej

• LBP jest syntetyzowane w wątrobie, fizjologiczne stężenie krwi jest niskie, rzędu 2-10 mg/l

• W uogólnionych zakażeniach stężenie LBP rośnie już po 6-12 h i może sięgać 100 i więcej mg/l z maksimum w 1-2 dobie

Proces przebudowy tkanki kostnej- obrót kostny (bone turnover, remodelling)

Kościotworzenie resorpcja kości

Czynniki mające wpływ na obrót kostny:

• PTH

• Witamina D

• Kalcytonina

• Hormon wzrostu

• Hormony płciowe

• Czynniki wzrostowe

• Cytokiny

• Składniki macierzy kostnej

Tkanka kostna struktura dwufazowa:

• Organiczna macierz kostna

• Kryształy hydroksyapatytu (składnik nieorganiczny)

W kości występują 3 rodzaje komórek:

• Osteocyty

• Osteoklasty

• Osteoblasty

Za metabolizm kostny odpowiadają osteoklasty i osteoblasty.

Osteoklasty- rola:

• Resorpcja tkanki kostnej z wytworzeniem zatoki- miejsca ubytku w strukturze tkanki kostnej

• Produkcja i wydzielanie m.in. winianoopornej kwaśnej fosfatazy, kolagenaz, proteinaz cysteinowych

• Synteza białek macierzy kostnej

• Wyściełanie osteoidem nowopowstałych zagłębień macierzy kostnej (zatok)

• Produkcja fosfatazy alkalicznej, osteokalcyny, kolagenu typu I i in.

Proces przebudowy wewnętrznej odbywa się w ściśle określonych miejscach szkieletu, zwanych jednostkami przebudowy kości (BRU- bone remodelling unit). Histologicznie jednostkę przebudowy w kości zbitej stanowi osteon, zaś w kości gąbczastej zatoka erozyjna (zatoka Howshipa).

Cykl przebudowy tkanki kostnej składa się z następujących po sobie dwóch przeciwstawnych procesów:

• Resorpcji

• Tworzena ( okres przejściowego spoczynku)

W stanie równowagi ilości resorbowanej i tworzonej kości są równe

• Resorpcja trwa krótko (kilka-kilkanaście dni) i markery resorpcji są intensywnie uwalniane w stosunkowo dużych ilościach

• Tworzenie trwa długo (kilkanaście tygodni) i markery tworzenia uwalniane są w małych ilościach

Kolagen typu I syntetyzowany jest przez aktywne osteoblasty w następujących etapach:

1. preprokolagen

2. prokolagen

3. tropokolagen

4. reaktywne aldehydy wiążące poprzecznie (sieciujące)

5. pochodne 3-hydroksy-pirydyniowe pirydynoliny i deoksypirydynoliny

6. dojrzały kolagen

Preprokolagen ma strukturę potrójnej helisy, w której 3 łańcuchy polipeptydowe (2 alfa₁ i 1 alfa₂) tworzą prawoskrętny superheliks. W łańcuchach alfa znamiennie częściej niż w innych białkach występują glicyna, lizyna, prolina i ich hydroksylowane pochodne: hydroksyprolina i hydroksylizyna.

Preprokolagen- budowa:

1. krótka sekwencja sygnałowa

2. N-końcowy propeptyd prokolagenu typu I (PINP)

3. C-końcowy propeptyd prokolagenu typu I (PICP)

Preprokolagen po odcięciu fragmentu sygnałowego jest w postaci prokolagenu uwalniany z komórki. W przestrzeni pozakomórkowej peptydy wydłużające są usuwane z N- i C-końców przez zewnątrzkomórkowe enzymy (amino- i karboksyproteinazy prokolagenu) i w ten sposób powstaje cząsteczka tropokolagenu). Następnie cząsteczki tropokolagenu układane są we włókna kolagenowe i następuje oksydacyjna deaminacja (z udziałem oksydazy lizolowej) grup aminowych reszt lizenowych i hydroksylizynowych do aldehydów. Powstają reaktywne aldehydy, które mogą ulegać kondensacji z podobnie powstałymi aldehydami. Następnie tworzone są wiązania sieciujące (kowalencyjne mostki poprzeczne), a ostatecznie następuje dojrzewanie cząsteczki kolagenu z wytworzeniem pochodnych 3-hydroksy-pirydyniowych:

• Pirydynoliny (PYD)

• Deoksypirydynoliny (DPD)

Zaburzenia metabolizmu kostnego.

W warunkach fizjologicznych tworzenie kości resorpcja kości.

• Osłabienie tworzenia (przy prawidłowej resorpcji) lub

• Nasilenie resorpcji (przy prawidłowym tworzeniu)

Prowadzi do zmniejszenia się masy kostnej (osteoporoza i inne choroby metabolizmu kości).

Zmiany ilościowe kości ocenia się przy użyciu densytometrii rentgenowskiej. Testy biochemiczne pozwalają na badanie dynamiki i kierunku zmian metabolizmu kostnego- badania o charakterze jakościowym.

Biochemiczne markery metabolizmu kości- nowoczesne i wysokospecyficzne wskaźniki procesów resorpcji i kościotworzenia

Oznaczane substancje są składnikami macierzy kostnej:

• Występują wewnątrz komórek macierzy (enzymy pochodzące z osteoklastów lub osteoblastów)

• Stanowią fragmenty białkowych elementów strukturalnych kości lub produkty ich degradacji

• Mogą być składnikami nieorganicznej struktury kostnej (głównie jony wapnia)

Na podstawie faz cyklu kostnego markery metabolizmu kostnego dzieli się na wskaźniki kościotworzenia i resorpcji kości.

Markery kościotworzenia	Markery resorpcji kości
1. frakcja kostna alkalicznej fosfatazy (b-ALP)	1. hydroksyprolina (OHP)
2. osteokalcyna (OC, BGP)	2. winianooporna kwaśna fosfataza (TRAP)
3. C-końcowy propeptyd prokolagenu typu I (PICP)	3. glikozydy hydroksylizynowe (GGHL, GHL)
4. N-końcowy propeptyd prokolagenu typu I (PINP)	4. karboksyterminalny telopeptyd kolagenu typu I (ICTP)
	5. pirydynolina i deoksypirydynolina (PYD, DPD)
	6. N-końcowy usieciowany telopeptyd łańcucha alfa kolagenu typu I (NTX)
	7. C-końcowy usieciowany telopeptyd łańcucha alfa kolagenu typu I (CTX)
	8. sjaloproteina kostna (BSP)

Markery kościotworzenia:

• Frakcja kostna alkalicznej fosfatazy (b-ALP)

• Osteokalcyna (OC, BGP)

• C-końcowy propeptyd prokolagenu typu I (PICP)

• N-końcowy propeptyd prokolagenu typu I (PINP)

Markery resorpcji kości:

• Winianooporna kwaśna fosfataza (TRAP)

• Hydroksyprolina (OHP)

• Glikozydy hydroksylizynoe (GGHL, GHL)

• Pirydynolina i deoksypirydynolina (PYD, DPD)

• Karboksyterminalny telopeptyd kolagenu typu I (ICTP)

• N-końcowy usieciowany telopeptyd łańcucha alfa kolagenu typu I (NTX)

• C0końcowy usieciowany telopeptyd łańcucha alfa kolagenu typu I (CTX)

• Sjaloproteina kostna (BSP)

Nowoczesne markery obrotu kostnego są:

• Cząsteczkami wysoce swoistymi dla metabolizmu tkanki kostnej

• Metody ich oznaczania wysoce specyficzne dla tych cząsteczek

• Wg ustaleń na Światowym Kongresie Osteoporoza 2000 do nowoczesnych markerów obrotu kostnego zalicza się:

• B-ALP

• Osteokalcyne

• PINP

• PYD i DPD

• NTX

• CTX

Charakterystyka markerów kościotworzenia

• Rutynowo oznacza się je we krwi

Frakcja kostna fosfatazy alkalicznej to czuły marker kościotworzenia. Jest stosowany jako wskaźnik skuteczności terapii antyresorpcyjnej. Wykazuje znamienny wzrost w:

• Chorobie Pageta

• Nadczynności przytarczyc i tarczycy

• Osteomalacji i osteodystrofii nerkowej

• Akromegalii

• Przerzutach nowotworowych do kości

b-ALP- ELISA (Alphase-B)

Metody oznaczania OC:

• Fragment N-końcowo-środkowy (główny produkt proteolizy)

• N-Mid Osteocalcin ELISA i IRMA

• N-mid Osteocalcin One Step ELISA

• System ELECSYS (metoda immunochemiluminescencyjna)

• Nienaruszoną cząsteczkę osteokalcyny oznacza

• Zestaw NovoCalcin w systemie ELISa lub

• Metoda automatyczna z wykorzystaniem systemy ELECSYS

Metody oznaczania PCICP i PINP

• PICP- metoda ELISA z zestawem Prolagen-C

• PINP- metoda RIA przy użyciu zestawu PINP

Osteokalcyna

Osteopontyna

• Sjaloproteina swoista dla kości

• Powstaje w komórkach macierzy kostnej

• Może tworzyć mostki między komórkami a substancją mineralną kości

• Marker resorpcji kości

Osteonektyna

Osteoprotegryna

NTX

• Jest obecnie najczulszym i najbardziej swoistym markerem resorpcji kości

• Jest to czuły marker w monitorowaniu

• Leczenia antyresorpcyjnego osteoporozy oraz choroby Pageta

• Terapii estrogenowej

• Jest najlepszym czynnikiem predykcyjnym wskazującym na tworzenie się przerzutów nowotworowych do kości

NTX i DPD oznaczane metodą HPLC stanowią markery o najwyższej użyteczności klinicznej ze względu na swoją wysoką swoistość.

Metody oznaczania NTX i CTX

NTX

• W moczu metodą ELISA- zestaw Osteomark

• W przygotowaniu jest metoda do oznaczania NTX w surowicy

CTX

• W moczu- CrossLaps ELISA i alfa CrossLaps RIA

• W surowicy

• Metodą manualną zestawem Serum CrossLaps One Step ELISA

• W systemie automatycznym ELECSYS

1

---