Model kinetyki procesu biosyntezy kwasu cytrynowego przez A. niger.

W przeciągu wieloletniej produkcji kwasu cytrynowego przez A. niger powstało wiele modeli kinetycznych opisujących proces biosyntezy. Modele te uwzględniają, oprócz samego procesu biosyntezy, także wzrost biomasy oraz procesy transportowe zachodzące podczas produkcji. Niektóre modele wskazują także na istniejącą silną zależność pomiędzy morfologią kropidlaka czarnego a produktywnością.

Podczas produkcji kwasu cytrynowego metodą wgłębną w fazie początkowej (trofazie) obserwuje się intensywny wzrost biomasy oraz tworzenie się głównego produktu. W idiofazie (faza stacjonarna) powstawanie kwasu cytrynowego jest na poziomie maksymalnym, zaś przyrost masy jest minimalny.

Źródłem węgla i energii jest cukier biały, który jest rodzajem cukru buraczanego wyróżnianego na podstawie cech oraz sposobu produkcji. Cukier biały charakteryzuje się brakiem zlepków i grudek (idealnie sypka konsystencja), brakiem obcych zapachów, charakterystycznym słodkim smakiem oraz odpowiednią barwą (od białej do kremowej). Oczywisty jest fakt, że do produkcji kwasu cytrynowego najlepiej nadają się substraty o dużej czystości chemicznej, w których zawartość przyswajalnych źródeł węgla jest zbliżona do 100%. Niewątpliwie stosowanie czystych surowców do produkcji jest mało ekonomiczne, jednakże rodzaj stosowanego substratu jest dyktowany przeznaczeniem gotowego produktu.

Substrat w trakcie fermentacji jest przekształcany w biomasę, dwutlenek węgla, wodę, kwas cytrynowy oraz produkty wtórne, do których zaliczamy wyższe alkohole (glicerol, arbitol, erytrilol, mannitol), a także inne kwasy organiczne (kwas jabłkowy, fumarowy, izocytrynowy), niektóre aminokwasy. Produkty uboczne są tworzone zarówno w trofofazie jak i w idiofazie. Uproszczony bilans procesu fermentacji można przedstawić następująco:

1. uwzględniający energetykę procesu

C₆H₁₂O₆+³/₂ O₂ C₆H₈O₇ + 2H₂O + 804 kJ

2. uwzględniający masę grzybni wytworzoną podczas fazy wzrostu (bilans Meyratha)

5C₆H₁₂O₆+6 O₂ 4 HOOC-CH₂-C(OH)(COOH(-CH₂))-COOH +6 (CH₂O) + 8 H₂O

Dla danych zawartych w tabeli poniżej przeprowadzono symulację wykresu zmian stężenia substratu (S), biomasy (X) i produktu (P) od czasu dla kinetyki Monoda opisanej następującym układem równań:

μmax [1/h]	0.013
Yx/s	0.103
Yp/x	8.53
Km [g/dm^3]	44
X0 [g/dm^3]	10
S0 [g/dm^3]	151
P0 [g/dm^3]	0

Parametry kinetyczne zebrane w tabeli dotyczą ciągle zasilanej hodowli okresowej (hodowla ciągle zasilana źródłem azotu). W wyniku przeprowadzonych symulacji otrzymano następujące wykresy.

Z wykresów odczytujemy, iż:

- stężenie biomasy rośnie szybko w czasie aż do ustalenia się pewnej granicznej wartości, w której wzrost zostaje praktycznie zahamowany (przy t=150),

- wraz ze wzrostem stężenia produktu maleje stężenie substratu,

- stężenie produktu (podobnie jak biomasy) rośnie w czasie aż do ustalenia się wartości stałej (przy t=150),

- największy przyrost produktu następuje w przedziale czasu 9 - 93 [h], gdzie maksimum produkcji przypada na t=63 [h],

- po przekroczeniu 93 godziny produkcja stopniowo maleje.

Optymalny czas hodowli dla uzyskanej symulacji wynosi około 154 godziny. Stężenie biomasy w tym czasie ustala się na poziomie 25.46 g/dm³, substratu 0.92 g/dm³, produktu 131.86 g/dm³. Dłuższe prowadzenie procesu staje się nieopłacalne, gdyż dalszy przyrost produktu jest niewielki, a gradient stężenia substratu dąży do 0. W tabeli poniżej zostały przedstawione wartości stężenia biomasy, substratu i produktu dla dalszych punktów w czasie.

czas [h]	X [g/dm^3]	S [g/dm^3]	P [g/dm^3]
154,182	25,458	0,922	131,857
171,285	25,525	0,268	132,432
184,913	25,543	0,099	132,580
201,101	25,550	0,030	132,640
214,539	25,552	0,011	132,657
230,641	25,553	0,003	132,664

Jak widzimy po 76 godzinach przyrost produktu w czasie wyniósł około 0.8 g/dm³, podczas, gdy ilość substratu zmalała do 0.003 g/dm³. Otrzymane wartości potwierdzają, ze dalsze prowadzenie procesu jest nieekonomiczne.

Przeprowadzono także symulacje mające określić wpływ początkowego stężenia substratu i biomasy na długość procesu. Uzyskane wyniki zostały przedstawione na poniższych wykresach. Po przeanalizowaniu otrzymanych danych (najważniejsze zebrane w tabelach poniżej) zauważamy, że wraz ze wzrostem stężenia początkowego substratu czas trwania procesu wydłuża się. Analogiczną sytuację uzyskujemy dla małych początkowych stężeń biomasy. W przypadku dużych stężeń biomasy i małych substratu czas trwanie procesu relatywnie się skraca. Oczywistym jest fakt, ze nie możemy dowolnie zmieniać parametrów. Większe stężenia początkowe substratu czy biomasy powodują wzrost lepkości roztworu, pogarszają warunki tlenowe oraz wymianę ciepła i masy, przez co trzeba zastosować intensywniejsze mieszanie i napowietrzanie, które wiążą się z większymi kosztami i obumieraniem biomasy (strzępki wykazują dużą wrażliwość na mechaniczne rozciąganie, ponadto powstaną duże ilości piany). Zaś z drugiej strony zastosowanie za małej ilości substratu lub początkowej ilości biomasy powoduje, że będzie utrudniony kontakt pomiędzy biomasą a substratem, w wyniku, czego powstaną, tzw. martwe strefy.

S0 [g/dm^3]	50	100	151	200	250	300
Czas [h]	132	146	154	161	165	170

X0 [g/dm^3]	1	5	10	20	30	40
Czas [h]	383	217	154	100	75	59

Model Monoda jest uproszczonym spojrzeniem na kinetykę procesu. Jest to model opisujący wzrost mikroorganizmów (biomasy) wskazującym na istnienie silnej zależności pomiędzy wzrostem, biosyntezą produktu a koncentracją głównego substratu będącego źródłem węgla i energii. Ograniczenia modelu wynikają z założeń, że produkcja (w zamyśle biosynteza) wymaga tylko jednego substratu (źródła węgla), który nie zakłóca procesu na żadnym etapie, a także nie uwzględnia limitacji przez inhibicję powstającym produktem (głównym lub ubocznymi), a także oporów dyfuzyjnych transportu zewnątrz- i wewnątrzkomórkowego. Model nie uwzględnia także takich czynników jak stężenie tlenu, szybkość poszczególnych enzymów szlaku metabolicznego, morfologii grzybni, wilgotności, pojemności środowiska, inhibicji wszelakiego rodzaju oraz transportu masy i ciepła, a także metabolizmu endogennego.

Pomimo, iż biologia kropidlaka czarnego jest dobrze poznana i opisana, stworzenie modelu matematycznego opisującego każdy możliwy czynnik (parametr) mający wpływ na biosyntezę kwasu cytrynowego mija się z celem i jest nieekonomiczne. Model Monoda w swojej prostocie daje dobre przybliżenie zachodzącego procesu i jest wystarczający do zaprojektowania odpowiedniej instalacji technicznej.

---