Deoksyrybonukleotydy w cząst. DNA i rybonukleotydy w cząsteczce RNA są połączone przez wiązanie fosfodiestrowe.
W pH obobojętnym każda grupa fosforanowa ma pojedynczy ładunek ujemny, dlatego łańcuchy polinukleotydowe nazywa się kwasami; są one anionami silnych kwasów;
Szkielet cukrowo fosforanowy znajdujący się na zewn. jest ujemnie naładowany.
Odległość między parami zasad wynosi 3.32A a jeden pełen skręt helisy to 33.2A; 1A to 1/10 nm;
1 pełny skręt helisy to 10 par zasad (bp)
Pomiędzy rdzeniami cukrowo-fosforanowymi przebiegają dwa rowki: mały i duży;
Nukleotyd: nukleozyd (zasada azotowa + cukier)mający jedną lub więcej grup fosforanowych związanych kowalencyjnie w pozycji 3' lub 5' (2' w rybonukleotydach);
Deoksyrybonukleotyd - zawiera deoksyrybozę
Rybonukleotyd - zawiera rybozę
Nukleotydy są połączone wiązaniem fosfodiestrowym ( kowalencyjne wiązanie reszt fosforanowych między grupą 5'-hydroksylową jednej rybozy (deoksyrybozy) a 3'-hydroksylową następnej)
Prekursory DNA:
-dATP (2'-deoksyadenozyno-5'-trifosforan);
-dCMP;
-dGMP;
-dTMP
STRUKTURA B (forma B lub B-DNA)
-zaprojektowana przez Watsona i Cricka
-tworzy się w r-rze soli fizjolog. w war. wysokiej wilgotności (92%)
-forma wyidealizowana struktury występującej In-vivo;
-charakteryzuje się heliakalnym powtórzeniem 10 par zasad na 1 skręt helisy;
-zasady są ułożone na osi helisy;
-obecność dobrze zdefiniowanych rowków małych dużych
-1 skręt helisy to 33.2 A
STRUKTURA A (forma A lub A-DNA)
-tworzy się w warunkach niskiej wilgotności (ok.75%)
-helisa prawoskrętn, ale struktura nieco szersza i krótsza niż forma B
-11 par zasad
-1 skręt helisy to 24.6A;
-głównie w hybrydach DNA-RNA
FORMA Z
-inaczej forma zygzakowata
-struktura lewoskrętna w syntetycznym dwuniciowym DNA składająca się z następujących po sobie reszt purynowych i pirymidynowych (poly[dG-dC]-poly[dG-dC];
-12 par zasad na 1 skręt helisy;
-niepoznana rola biologiczna;
Tm-temperatura topn. w której nić DNA jest w połowie denaturowana, topnieniu towarzyszy wzrost absorbancji; kwasy nukleinowe absorbują światło UV o dług. fali 260 nm; zdolność do absorpcji światła wykorzystuje się do wykrywania, oznaczania ilościowego i określania stopnia czystości; t. topn. mieści się w granicach 80-100 stopni.
Replikacja semikonserwatywna - każdy powastający dupleks zawiera jedna nić rodzicielską i jedna nowo syntezowaną
Replikacja nieciągła - polimeraza syntetyzuje DNA tylko w kier. 5' 3'; nić wiodąca to replikacja ciagła, nić opóźniona to replikacja nieciagła
STARTER
-fragment kwasu nukleinowego RNA;
-proces replikacji nie zaistnieje bez startera (jego odkycie przez T.Okazaki)
-DNaza nie degraduje całkowicie fragmentów Okazaki; po trawieniu fragmentów DNA powstaja małe kawałki kwasu nukleinowego o długości 10-12 par zasad;
Dwukierunkowość replikacji:
-model theta - występuje w przyp. kolistych cząst. DNA; tworzy widełki replikacyjne; replikon - DNA będące pod kontrolą jednego miejsca inicjacji replikacji; każdy odicnej DNA replikuje jako pojedyncza jednostka
-plazmid ColE1 (Coli Esch.)-przykład replikacji jednokierunkowej.
-replikujące się cząsteczki przypominaja literę theta. (powstają dwie kuliste cząsteczki)
-dwie koliste cząsteczki połączone ze sobą to katenaty
-model toczącego się koła- np. u faga ΦX174;
-dwuniciowe cząst. DNA są formami replikatywnymi które w wyniku replikacji daja konkatamery (kopie o zwielokrotnionej długości) liniowego DNA;
Miejsce „ori”
-DnaA box - m-sce rozpoznawane przez białko inicjatorowe DnaA;
-białko inicjatorowe DnaA tworzy kompleks inicjatorowi składający się z 30-40 podjednostek, z których każda związana jest z ATP; wokół takiego kompleksu nawija się DNA;
-DnaA stymuluje topnienie DNA w miejscu 13 powtarzających się sekwencji po lewej stronie DnaA box;
-DnaA umozliwia przyłączenie się białka DnaB (helikazy);
-białka wiążące DNA (Ssb) - uczestniczą w rozdzielaniu nici DNA podczas replikacji (wspomaganie działania helikazy);
-helikaza przy udziale ATP rozdziela nici i tworzy widełki replikacyjne;
-prymaza syntetyzuje krótki starter RNA o długości od 3 do 20 nukleotydów;
-białko HU - wiąże się z DNA i wspomaga tworzenie „otwartego kompleksu”
Pol I (polimeraza DNA I)
-odkryta przez Kornberga
-102-kD pojedynczy łańcuch polipeptydowi;
-posiada:
-aktywność polimerazy;
-aktywność egzonukleazy 3' 5' (sprawdzanie poprawności replikacji)
-aktywność egzonukleazy 5' 3'
-pełni zasadniczą rolę w naprawie uszkodzonego DNA (uzupełnienie przestrzeni po zabudowanym DNA)
Aktywność polimerazy (syntetyzuje DNA w kierunku 5' 3', a czyta nić matrycową w kierunku 3' 5')
Eukariotyczne polimerazy DNA
-kom. zwierzęce zaw. 5 różnych polimeraz
-u E.Coli 3 polimerazy
-polimeraza DNA delta - prowadzi replikację na obu niciach (wysoce wydajną) i wydaje się być głównym enzymem odpowiedzialnym za proces replikacji w komórkach eukariotycznych;
MECHANIZMY REPLIKACJI
I.Inicjacja
-proces rozpoczyna się syntezą startera;
-prymaza - enzym syntetyzujący starter (białko DnaG produkt genu dnaG);
-do syntezy startera niezbędne jest białko DnaB (helikaza);
-prymosom-ruchomy kompleks białkowy zawierający prumazę (DnaG i DnaB) i helikazę niezbędny do syntezy starterów w procesie replikacji;
-do nici opóźnionej prymosom rozmieszcza startery co 1000-2000 nukleotydów;
-proces replikacji rozpoczyna się w miejscu „ori”, u E.Coli „oriC”;
II.Elongacja
-synteza rozpoczyna się w momencie przyłączenia startera;
- w kom. prokariot. elongacja prowadzona jest przez holoenzym polimerazy III DNA, u eukariota - DNA polimeraza δ;
-rdzeń pol III (podjednostki αε i αεθ) nie replikuje wydajnie; syntetyzuje krótkie fragmenty DNA i oddysocjowuje od nici matrycowej; wydajna replikacja zachodzi tylko w obecności podjednostki β;
-polimeraza III DNA syntetyzuje DNA z szybkościa 730 nukleotydów
-β podjednostka występuje w formie dineru i tworzy pierścień wokół nici DNA;
-pierścień oddziałuje z podjednostką α rdzenia polimerazy i łączy polimerazę z nicią matrycową;
III. terminacja
-widełki replikacyjne dochodzą do miejsca terminacji replikacji;
-miejsce końca replikacji to 22 nukleotydowa sekwencja Tera-TerF wiażąca białka Tus (terminus utilization substancje); białko Tus jest inhibitorem helikazy;
Pol I w warunkach łagodnej degradacji proteolitycznej jest cięta na 2 łańcuchy polipeptydowe:
1.fragment Klenowa - duży fragment mający aktywność polimerazy i egzonukleazy 3' 5';
-wykorzystywany w biologii molekularnej jako polimeraza klenowa do uzupełnienia końców cząsteczek DNA (tworzenia tzw. tępych końców);
2. mały fragment o aktywności egzonukleazy 5' 3'
Aktywność egzonukleazy 3' 5'
-proofreading czyli sprawdzanie poprawności procesu replikacji;
Aktywność egzonukleazy 5' 3'
-pozwala na degradację nici przed polimerazą;
-bierze udział w usuwaniu starterów;
Pol III (polimeraza DNA III)
-polimeraza DNA III jest holoenzymem, składającym się z wielu podjednostek;
-każda podjednostka ma zdolność syntezy DNA, ale proces ten zachodzi bardzo wolno;
-rdzeń polimerazy DNA III jest bezpośrednio odpowiedzialny za szybki proces replikacji (1000 nukleotydów/sek);
Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR)
Polimeraza DNA jest jednym i kluczowym enzymem tego procesu, stabilnym w temperaturze do 96 stopni C. Po raz pierwszy enzym ten wyizolowano z termofilnej bakterii Thermus aquaticus, żyjącej w gorących gejzerach parku narodowego Yellowstone.
PCR wykorzystuje się do amplifikacji fragmentów DNA do klonowania, jak również w diagnostyce molekularnej (infekcje wirusowe, choroby genetyczne).
Klonowanie
Klonowanie-produkcja dużej liczby identycznych cząsteczek DNA, komórek lub organizmów z pojedynczej wyjściowej (rodowej) cząsteczki DNA, komórki lub organizmu.
Klon-zestaw identycznych cząsteczek DNA, komórek lub organizmów.
Hybrydyzacja
Jest to Renaturacja komplementarnych pojedynczych nici kwasu nukleinowego prowadząca do powstania podwójnej helisy.
Stringency - hybrydyzacja powinna zachodzić w warunkach, w których tolerowane są pewne niedokładności w parowaniu komplementarnych nici.
Plazmidy - małe (2-15 kbp) koliste cząsteczki DNA bakteryjnego, które replikują się niezależnie od genomu gospodarza.
Cechy plazmidów:
-zawierają geny oporności na antybiotyki (marker selekcyjny);
-zawierają początek replikacji ori;
-zawierają sekwencje rozpoznawane przez wiele enzymów restrykcyjnych (polylinker);
-mogą zawierać promotory do ekspresji DNA w bakteriach, drożdżach i komórkach zwierzęcych;
Typowy wektor plazmidowy może przenosić fragmenty DNA wielkości do 10,000 par zasad, a większe inserty mogą być przenoszone z mniejszą wydajnością. Większe cząsteczki DNA mogą być efektywnie klonowane w sztucznych chromosomach bakteryjnych (BAC), do których należą specjalne plazmidy i fag lambda.
Elektroforetyczna migracja DNA w żelu agarozowym zależy od:
1).rozmiaru molekularnego cząsteczki DNA
-DNA wędruje w żeli agarozowym z szybkością odwrotnie proporcjonalną do log z masy cząsteczkowej;
2).Stężenia agarowy
-zależność liniowa między log mobilności elektroforetycznej a stężeniem żelu - wyższe stężenie procentowe żelu tym lepiej rozdzielane są małe cząsteczki;
3).Konformacji cząsteczki DNA
-forma kolista DNA, rozcięta forma forma kolista DNA i forma liniowa DNA o tej samej masie cząsteczkowej wędrują z różną szybkością;
4).Przyłożonego napięcia
- zalecane napięcie to 5V/cm; przy takim napięciu migracja linearnej cząsteczki DNA jest proporcjonalna do napięcia przyłożonego;
Sondy molekularne - syntetyzowane w reakcji PCR a następnie znakowane przy użyciu kinezy polinukleotydowe PNK (kineza dodaje radioakt. grupy fosforanowe na 5' koniec nici DNA). Produkt PCR - dodanie α32PdNTP do ostatnich cykli. f.dNTP które znakowane są chemicznie (fluorescencyjnie).
Rozdzielenie nici DNA
Denaturacja - prowokowana przez:
-niskie stężenie soli
-pH alkaliczne
-organiczne rozpuszczalniki, np.formamid (HCONH2)
-temperaturę w zakresie 60-95 stopni
Renaturacja - prowokowana przez:
-wysokie stężenie soli
-pH neutralne
-temperaturę niższą od Tm o ok. 15 stopni C
-wysoka zawartość par GC
Endonukleazy restrykcyjne (typ II)
Endonukleazy restrykcyjne (typ II)-enzymy, wyizolowane z bakterii, rozpoznające krótkie palindromowe sekwencje 4-8 nukleotydowe i przecinające DNA w tych specyficznie rozpoznanych miejscach.
W bakteriach enzymy restrykcyjne mają zdolność degradować tylko obce DNA wnikające do komórki. DNA własne komórki jest modyfikowane chemicznie przez metylację - system zabezpieczenia przed działaniem endonukleaz.
Endonukleazy - przecinaja DNA w środku nici
Egzonukleazy - przecinają DNA na końcach
Typ I - rozpoczynają specyficzne sekwencje DNA ale trawią je rzadko
Typ III - rozpoznaje specyficzne sekwencje, ale tnie DNA w odległości ok. 20-25 nukleotydów od miejsca rozpoznawanego
Uszkodzenia powodowane przez UV
-promieniowanie UV powoduje krzyżowe wiązania pirymidyn w tej samej nici DNA i powstawanie cyklobutanowych dimerów pirymidynowych (pierścienia butanowego);
-zasady w pierścieniu cyklobutanowym nie mogą parować z zasadami nici przeciwnej, co powoduje lokalną denaturację DNA i duże uszkodzenie;
-następuje zahamowanie replikacji; jeżeli replikacja zachodzi powstają mutacje;
-UV to promieniowanie o niskiej energii powoduje umiarkowane zmiany;
Promieniowanie gamma i rentgenowskie
-oddziałują bezpośrednio z DNA (jonizują cząsteczki wody wokół DNA powodując powstawanie „wolnych rodników”);
-wolne rodniki to reaktywne związki tlenu z niesparowanym elektronem;
-wolne rodniki powstają również w reakcjach metabolizmu tlenowego;
-najczęstszy produkt utleniania to 8-oksyguanina (oxoG),czytana przez polimerazę jako tymina;
-brak procesów naprawy prowadzi do mutacji;
-promieniowanie może powodować pęknięcia jednej lub obu nici DNA (trudne do usunięcia);
Denaturacja termiczna DNA (topnienie DNA)
-chociaż stosunek ilościowy G do C i A do T jest w DNA stały to procentowa zawartość CG może być różna w różnych cząsteczkach DNA;
-zawartość procentowa par GC waha się pomiędzy 22% a 73% i wpływa na fizyczne właściwości DNA;
-zawartość par GC ma zasadniczy wpływ na denaturację termiczną DNA;
-topnienie DNA (denaturacja) -rozdzielenie podwójnej helisy DNA na 2 osobne nici pod wpływem temperatury;
Bezpośrednia naprawa DNA:
1.Fotoreaktywacja
-naprawa światłem;
-zachodzi dzięki obecności enzymu fotoreaktywującego-fotoliazy;
-fotoliaza rozpoznaje uszkodzone miejsca w DNA i wiąże się z DNA w tym miejscu (dimer pirymidyny);
-fotoliaza absorbuje światło niebieskie (widmo UV-A) i przenosi energię na pierścień cyklobutanowy, który następnie ulega rozszczepieniu;
-fotoreaktywacja jest swoista dla dimerów pirymidynowych;
-FOTOREAKTYWACJA NIE ZACHODZI W KOMÓRKACH LUDZKICH;
2.Alkilotransferaza
-usuwanie alkilacji z O-6 guaniny (O-6-metyloguanino metylotransferaza);
-czynnikiem ochronnym przed mutagennymi skutkami alkilacji jest alkilotransferaza;
-alkilotransferaza usuwa grupy alkilowe (metylowe lub etylowe) bezpośrednio z mutagennej O-6-guaniny) na siebie (akceptorem jest siarka w cysternie);
-alkilotransferaza po przyłączeniu grupy etylowej lub metylowej zostaje nieodwracalnie inaktywowana - tzw. samobójczy enzym;
-synteza enzymu indukowana jest przez alkilację DNA;
Bakteryjne białka RecBCD i RecA
I. Rec BCD:
-wielofunkcyjny kompleks białkowy;
-posiada: aktywność helikazy (zależnej od ATP), egzonukleazy 5' 3' i 3' 5';
-przecina cząsteczkę DNA w pobliżu miejsca Chi;
-działanie RecBCD pozwala na powstanie jednoniciowego ogona otoczonego białkiem A i białkami SSB;
II. Rec A:
-białko wielofunkcyjne;
-wiąże się z pojedynczą nicią DNA;
-kompleks RecA i ssDNA wiąże się do podwójnej nici, tzw.kompleks inwazyjny;
-stymuluje przemieszczania się ramion;
Rekombinacja zlokalizowana
-zachodzi tylko w obrębie ściśle określonych sekwencji;
-w proces ten zaangażowane są enzymy - rekombinazy; rekombinaza umozliwia łączenie się dwóch cząsteczek DNA;
-przykłady: 1. integracja faga λ oraz 2.transpozycja
Mechanizmy typu „bypass”
-mechanizmy fotoreaktywacja, alkilotransferaza, naprawy poprzez wycinanie zasad i nukleotydów (BER i NER) oraz naprawa źle sparowanych zasad (mismatch repair) to prawdziwe systemy naprawy prowadzące do eliminacji uszkodzonego DNA;
-mechanizmy typu bypass zachodzą, gdy DNA zostało zreplikowane (bez usunięcia uszkodzeń) lub też DNA zreplikowało się a komórka uległa podziałowi przed naprawieniem uszkodzeń;
-rekombinacyjna naprawa uszkodzeń-naprawa postreplikacyjna -uszkodzona nić rekombinuje z nicią prawidłową; efekt netto: rekombinacja pozwala na usunięcie luki w nici DNA w miejscu uszkodzenia i odbudowanie rekombinowanej nici przez polimerazę DNA; uszkodzenie istnieje, ale komórka zdołała zreplikować swój materiał genetyczny;
REKOMBINACJA OGÓLNA - cechy ogólne
1.Wymieniane są sekwencje homologiczne;
2.zachodzi w miejscach, gdzie występują sekwencje homologiczne;
3.Nie zachodzi wbudowywanie lub gubienie nukleotydów w miejscach rekombinacji, a małe zmiany mismatch są tolerowane;
MUTACJE
1.Błędy replikacyjne
-zachodzą z częstotliwością 10 -8;
2.Depurynacja
-spontaniczna hydroliza wiązań β-N-glikozydowych spowodowana zmianami temperatury w jądrze komórkowym;
-zachodzi z częstotliwością: 5000/komórkę/dzień;
3.Deaminacja
-zachodzi spontanicznie z częstotliwością 100/komórkę/dzień;
-produktem deaminacji jest nienaturalna zasada w DNA (w ten sposób można rozpoznać tę mutację);
C U
A HX (hypoksantyna)
G X (ksantyna)
4.Alkilacja
-kowalencyjne dołączenie reszt alkilowych lub innych grup chemicznych (metyzacja, dołączenie benzopirenów-papierosy)
-elektrofile (substancje elektrofilne czyli lubiące elektrony lub cząsteczki ujemnie naładowane)atakują ujemnie naładowane DNA dodając grupy węglowe czyli grupy alkilowe;
-najbardziej podatne na alkilację są: N7 guaniny (nie zmienia zasad parowania) i N3 adeniny: alkilacja adeniny prowadzi do powstania 3-metyl-adeniny (3mA);
3mA jest zasadą niekodującą i nierozpoznawaną przez polimerazę DNA, hamującą replikację; tego typu inhibicja jest cytotoksyczna dla komórki i może doprowadzić do śmierci komórki;
Możliwe efekty mutacji punktowych wewnątrz regionów kodujących:
-konsekwencje tranzycji lub transwersji w genie kodującym (ramce odczytu) mogą być:
1.neutralne - nie zajdą zmiany w sekwencji aminokwasowej;
2.missense - zmieniająca sens, następuje zmiana 1 aminokwasu;
3.nonsense - powoduje powstanie kodonu stop prowadzącego do skrócenia sekwencji aminokwasowej białka;
Strategia „global genom NER”
-kompleks białkowy XPC i hHR23B rozpoznaje uszkodzenie i wiąże się z DNA; każde uszkodzenie w DNA;
-kompleks ten rekrutuje następne białka: XPA, RPA i TFIIH (czynnik transkrypcyjny II); podjednostka XPB i XPD TFIH mają aktywność helikazy i propagują miejscowe topnienie; RPA rekrutuje również excinuclease, która wycina uszkodzony fragment;
Naprawa źle sparowanych zasad (mismatch repair)
-ma na celu naprawę błędów pozostawionych po replikacji i powstałych w wyniku działania polimerazy DNA i nie skorygowanych w procesie proofreading;
-pozwala na naprawę źle sparowanych zasad lub krótkich inercji/delecji;
- w parach zasad źle dobranych podczas replikacji niewłaściwa zasada znajduje się na nici potomnej;
-system naprawy musi mieć sposób na odróżnienie rodzicielskiej od potomnej, aby zapewnić usuwanie nieprawidłowych zasad tylko z nici potomnej;
-nić rodzicielska zawiera „znaczniki” (tag) w postaci grup metylowych dołączonych do adeniny (metylacja DNA);nić potomna jest metylowana z opóźnieniem;
-mechanizm wyjaśniono u E.Coli, wciąż nie do końca jasny u eukariota;
Wycięcie zasady (BER):
-dotyczy powszechnych i subtelnych zmian w zasadach DNA, np.chemiczna modyfikacja spowodowana przez czynniki komórkowe;
-DNA glikozylaza - rozpoznaje uszkodzenie w DNA;
-DNA glikozylaza przecina wiązanie N-glikozydowe między zmienioną zasadą a cukrem, czyli wycina zasadę i powstaje miejsce purynowe lub apirymidynowe (miejsce AP);
-miejsce AP jest rozpoznawane przez AP endonukleazę, która przecina nić DNA po stronie 5' od miejsca AP;
-DNA fosfodiestraza usuwa AP deoksyrynezę (ufosforylowany cukier), DNA polimeraza I uzupełnia lukę w nici DNA;
Wycięcie nukleotydu (NER)
-usuwanie poważnych uszkodzeń;
-endokleaza rozcina nić DNA po obu stronach uszkodzenia w miejscach odległych od niego o ściśle określoną liczbę zasad;
-uvrABC nukleaza zbudowana jest z 3 łańcuchów polipeptydowych produktów genów ugra, uvrB i uvrC;
-wielkość wyciętego fragmentu zależy od rodzaju uszkodzenia (alkilacja czy dimer pirymidyny); średnio ok.12-13 nukleotydów;
TRANSKRYPCJA
eukariotyczna |
prokariotyczna |
Miejsce startu transkrypcji to tzw. miejsce +1 |
|
3 polimerazy RNA-każda rozpoznaje unikalne czynniki transkrypcyjne związane do promotorów; Polimeraza I - rRNAs (wyjatek 5S) Polimeraza II- mRNAs Polimeraza III-tRNAs + 5S rRNA |
1 polimeraza RNA syntetyzuje wszystkie rodzaje RNA |
mRNA jest monocistronowe |
mRNA jest policistronowe |
Sekwencje -25(TATA) i -75(CAAT box); |
Sekwencje -35(TTGACA) i -10 (TATA box); |
3' koniec jest poliadenylowany a introny są wycinanie; |
Czynnik δ wiąże się z polimerazą RNA i zwiększa jej specyficzność do promotora; |
Terminacja rho - NIEZALEŻNA
-polimeraza RNA syntetyzuje nukleotydy tworzące strukturę spinki do włosów;
-struktura spinki destabilizuje hybrydę RNA-DNA;
-transkrypt i polimeraza RNA oddysocjowuja od matrycy DNA;
Terminacja rho - ZALEŻNA
-białko rho jest heksametrem zbudowanym z identycznych podjednostek;
-terminatory zależne od rho są strukturami spinki, ale bez następujących po niej reszt U, które są niezbędne w terminatorach niezależnych od rho;
_________________________________________________
OPERON
-jednostka ekspresji składająca się z kilku genów, które kodują białka o podobnej funkcji; wszystkie geny zawarte w operonie są regulowane wspólnie;
lub/I
-jednostka ekspresji genów, która zawiera koordynacyjnie regulowane geny (geny struktury) i elementy kontrolne, rozpoznawane przez produkty genu regulatorowego;
Kontrola pozytywna
-operon laktozowy jest nieaktywny tak długo jak długo glukoza jest obecna w środowisku - w ten sposób faworyzowany jest metabolizm glukozy i represjonowane uzycie źródła energii - represja kataboliczna;
-pozytywna kontrola operony lac (oraz niektórych peronów związanych z kodowaniem enzymów metabolizmu cukrów jest mediowana poprzez białko CAO wiązące cAMP;
-białko CAP to kataboliczne białko aktywatorowi wiążące cAMP; stężenie cAMP jest obniżane przez glukozę (glukoza hamuje transkrypcję peronu lac);
-w operonie miejscem wiązania kompleksu CAP-cAMP jest tzw. miejsce wiązania aktywatora powyżej promotora; miejsce wiązania CAP zawiera sekwencję TGTGA;
-lac operon to tzw. słaby operon; wymaga kompleksu aktywatorowego w postaci CAP-cAMP;
lac operon (E.Coli):3 geny (pozwalają bakterii na metabolizm laktozy)
permeaza galaktozydowa (lacY)-transporter
β-galaktozydaza (lacZ)-enzym kataboliczny
transacetylaza galaktozydowa (lacA) -?
RNA policistronowe - RNA zawierające informacje z więcej niż jednego genu, a każdy cistron ma swoje miejsce wiązania rybosomu.
______
Operon tryptofanowy E.Coli zawiera 5 genów kodujących enzymy syntezy tryptofanu.
Operon tryptofanowy regulowany jest poprzez:
1.represja - trp represor (w obecności tryptofanu);
2.Atenuacja (transkrypcyjna, w obecn. tryptofanu)
Represja operonu występuje przy wysokim stężeniu tryptofanu.
________
Infekcja fagowa
-fag, np. SPO I B. subtillis, infekując komórkę bakteryjną używa maszynerię transkrypcyjną gospodarza do syntezy własnych białek;
-gp28 białko wczesne zastępuje czynnik sigma 43 polimerazy RNA gospodarza;
___
Operon arabinozowy
-operon kodujący enzymy niezbędne w metabolizmie arabinozy;
-operon kataboliczno-represyjny;
-charakteryzuje się:
1.obecnością 2 operatorów: araO1 i araO2;
2.araO1 kontroluje transkrypcję genu białka kontrolnego araC;
3.araO2 znajduje się powyżej promotora araPBAD w pozycji -265 do -294;
4.araPc miejsce wiązania CAP znajduje się około 200 bp powyżej promotora;
-regulacja negatywna mediowana jest przez białko araC kodowane przez araC;
__
-represja-operator araO2 kontroluje transkrypcję będąc ok.200bp powyżej promotora dzięki tworzeniu pętli;
-białko araC (produkt genu araC) przy braku arabinozy wiąże się do operatora araO2 k i aral1 k tworząc pętlę i uniemożliwiając wiązanie się polimerazy RNA do promotora;
-w obecności arabinozy (przy braku glukozy) następują zmiany konfirmacyjne w białku araC-białko araC wiąże arabinozę i oddziałuje z aral1 i aral2: dodatkowo kompleks Cap-cAMP wiąże się z araPc(miejscem wiązania kompleksu CAP-cAMP); umozliwia to wiązanie polimerazy do promotora i transkrypcję genów struktury;
--
geny struktury - geny kodujące enzymy uczestniczące w specyficznych szlakach biosyntezy, których ekspresja jest skoordynowanie kontrolowana;
geny operatora-sekwencja DNA(gen) regulująca transkrypcję genów struktury;
gen regulatorowy-produkt tego genu rozpoznaje elementy kontrolne (aktywator lub represor)
--
Kontrola negatywna
-z operatorem związany jest represor (białko represorowe)
-represor czyli lac represor to produkt genu lac I; jest to białko zbudowane z 4 identycznych podjednostek;
-represor wiąże się z operatorem - operon podlega represji (hamowaniu);
-represor zapobiega wiązaniu się polimerazy RNA do promotora;
-represor jest białkiem allosterycznym;
-do represora wiąże się induktor - allolaktoza;
--
Helisa -skręt - helisa
Struktura zbudowana z ok. 20 aminokwasów z dwoma α-helisami rozdzielonymi β-skrętem (zwykle 4 aminokwasy z Gly lub Pro). Jedna z helis jest tzw. helisa rozpoznającą, zawiera Gln, Asn, Arg, które wiążą się specyficznie do zasad w dużym rowku.
Lac represor posiada ok. 100X silniejsze powinowactwo do sekwencji operatora niż do sekwencji nie-promotorowej.
--
Helisa 1: nie wiąże się z dużym rowkiem, może oddziaływać z innymi miejscami w DNA;
Helisa 2: helisa rozpoznająca sekwencje w dużym rowku; dopasowanie z parami zasad i szkieletem cukrowo-fosforanowym;
β-skręt: elastyczny linker łączący 2 helisy i wpływający na ich orientację;
--
Regiony czynnika sigma
region 1
-znajduje się tylko w głównych czynnikach sigma (δ70 i δ43);
-zapobiega wiązaniu się samego czynnika sigma do DNA, gdy brakuje rdzenia polimerazy;
Region 2
-znajduje się we wszystkich czynnikach sigma;
-wysoce konserwatywny;
-wyróżnia się w nim 4 domeny (2.1-2.4);
-domena 2.4 rozpoznaje sekwencję -10;
-region niezbędny dla aktywności czynnika δ;
Region 3
-odpowiada za wiązaniem czynnika δ zarówno z DNA jak i rdzeniem polimerazy;
Region 4
-wyróżnia się w nim 2 domeny: 4.1 i 4.2;
-pełni zasadniczą rolę w rozpoznawaniu promotora;
-domena 4.2 wiąże się z sekwencją -35';
--
Terminacja:
-rho -NIEZALEŻNA
-transkrypcja zatrzymuje się na sekwencji terminacyjnej czyli sygnale stop; sygnałem stop jest struktura spinki do włosów (ramię i pętla);polimeraza zatrzymuje się po zsyntetyzowaniu struktury spinki;
-powstanie tej struktury uzależnione jest od sekwencji odwrotnych powtórzonych i występujących po nich regionów bogatych w T (tyminę);
-struktura spinki do włosów destabilizuje hybrydę RNA i DNA i sprzyja oddyscojowaniu RNA z kompleksu transkrypcyjnego (nici matrycowej);
-rho-zależna
-zakończenie transkrypcji uzależnione jest od białka rho;
-białko rho to wiąże się do rosnącego łańcucha transkryptu i podąża za polimerazą, umożliwiając polimerazie zatrzymanie się w miejscu terminacyjnym zależnym od białka rho;
-białko rho wiąże się z odcinkiem RNA na długości od 60 do 100 nukleotydów, nie posiada powinowactwa do polimerazy RNA;
--
Transkrypcja
Transkrypcja przebiega w trzech etapach:
1)Inicjacja
-enzym rozpoznaje promotor leżący powyżej genu transkrybowanego;
-w miejscu wiązania polimerazy dochodzi do lokalnego topnienia DNA;
-polimeraza RNA syntetyzuje RNA używając jako substratów 4 rybonukleozydofosforany: ATP, GTP, CTP i UTP; rozpoczynającym nukleotydem jest zazwyczaj uryna (A lub G);
-po przyłączeniu drugiego nukleotydu tworzy się pierwsze wiązanie fosfodiestrowe w łańcuchu RNA i rozpoczyna się proces elongacji;
2)Elongacja
-dołączanie rybonukleozydów do łańcucha RNA w kierunku 5' 3';
-w miejscu działania polimerazy dochodzi do lokalnej denaturacji DNA;po przejściu polimerazy dwuniciowe struktura DNA jest natychmiast odbudowywana;
3)Terminacja
-zachodzi w określonym miejscu terminacji transkrypcji, tzw. terminatory transkrypcji;
-polega na obniżeniu powinowactwa pomiędzy produktem (RNA) i matrycą (DNA);
--
Czynnik sigma
-wybiera geny do transkrypcji;
-powoduje ścisłe wiązanie polimerazy RNA z promotorem;
-oddysocjowuje od rdzenia po związaniu polimerazy z promotorem i po stabilizacji produktu z matrycą;
-stymuluje inicjację transkrypcji i po oddysocjowaniu może być ponownie użyty - tzw. recykling.
--
Zamknięty i otwarty kompleks promotora
-holoenzym polimerazy RNA wiąże się luźno bezpośrednio do promotora; kompleks jest zamknięty, ponieważ DNA zostaje w formie zamkniętej dwuniciowej;
-holoenzym indukuje topnienie DNA w obrębie promotora i wtedy dochodzi do ścisłego związania polimerazy RNA do DNA;
-otwarty kompleks promotora tworzy się w wyniku lokalnego topnienia DNA;
-czynnik sigma umożliwia inicjację transkrypcji poprzez tworzenie ścisłego wiązania holoenzym polimerazy RNA z promotorem
--
Dodatkowe elementy promotora
Element UP - część rdzenia promotora, oddziałuje z polimerazą RNA
Miejsca Fis-biorą udział w aktywacji i wzmacnianiu transkrypcji (enhancer); NIE są częścią rdzeni promotora (NIE wiążą polimerazy RNA)