Wykład 13 Toksykometria

Toksykometria - dział toksykologii doświadczalnej, której zadaniem jest ocena toksyczności substancji chemicznych. Obejmuje ona zbiór metod i technik badawczych pozwalających zarówno jakościowo jak i ilościowo ocenić szkodliwe czynnościowe lub morfologiczne działanie badanych substancji. Celem badań toksykometrycznych jest ustalenie w przybliżeniu, mechanizmów działania substancji toksycznej.

Etapy pomiarów toksykometrycznych:

• określenie toksyczności ostrej

• określenie toksyczności podostrej (krótkoterminowej „ test poszukiwania dawek”)

• określenie toksyczności podprzewlekłej (subchronicznej)

• określenie toksyczności przewlekłej

• badanie działania rakotwórczego

• badanie działania mutagennego

• badanie działania teratogennego

• badanie wpływu na płodność, rozrodczość i potomstwo

• badanie działania uczulającego oraz drażniącego

• badanie działania neurotoksycznego

Toksyczność - jest zdolnością substancji chemicznej do wywołania uszkodzeń organizmu

Skutek biologiczny - jest dowolną, odwracalna, mierzalną zmianą w organizmie, narządzie, tkance lub komórce, wywołaną lub związaną z narażeniem na substancję chemiczną.

Dawka - jest ilością substancji podaną m.in. dożołądkowo, dootrzewnowo, naskórnie, podskórnie lub pobraną z powietrzem wdychanym, paszą lub wodą do picia. Dawkę wyraża się na ogół jako masę substancji na jednostkę masy ciała (mg/kg) lub jego powierzchnię.

Odpowiedź- jest to skutek działania substancji chemicznej na organizm wyrażony liczbą lub odsetkiem osobników, które zareagowały na tę substancję

Dawka - efekt - jest ilościową zależnością między dawką a wielkością skutku biologicznego u pojedynczego osobnika lub części populacji.

Dawka - odpowiedź - jest zależnością między dawką substancji a liczbą lub odsetkiem osobników, u których wystąpił określony skutek biologiczny

Zwierzęta doświadczalne

Dodatnia strona badań na zwierzętach:

• możliwość doboru odpowiedniej liczebności grup doświadczalnych

• uzyskanie odpowiedniej grupy kontrolnej

• standaryzacja warunków i środowiska życia zwierząt

• kontrola parametrów narażenia

• uniknięcie narażenia łącznego

ujemna strona badań na zwierzętach:

• różnica w długości życia ludzi i zwierząt

• trudności w uzyskaniu informacji o reakcji zmysłów

• zmienność gatunków i szczepów

• różnice w reaktywności biologicznej człowieka i zwierzęcia

Metody alternatywne - są to procedury, które mogą całkowicie zastąpić badania na zwierzętach, ograniczyć ich liczbę lub zmniejszyć stres i ból odczuwany podczas eksperymentów.

Metody alternatywne mają na celu zastąpienie doświadczeń wykonywanych na zwierzętach eksperymentami przeprowadzonymi „w probówce” (in vitro) lub za pomocą analizy komputerowej (in silico). W przypadku, gdy całkowite zastąpienie zwierząt modelem in vitro jest niemożliwe, priorytetem jest ich humanitarne traktowanie, dlatego też metody alternatywne to nie tylko metody in vitro, ale również ulepszone, zmodyfikowane metody in vivo.

Metody alternatywne to metody spełniające jedną lub wszystkie zasady 3R zaproponowane przez Russela i Burcha w 1959r.

Walidowane testy alternatywne

Działanie żrące - test wykorzystujący model ludzkiej skóry EpiSkin

- test przez skórnej oporności elektrycznej z wykorzystaniem skóry szczura

Działanie fototoksyczne - test wychwytu czerwieni obojętnej przez fibroblasty 3T3

Działanie uczulające - test spływowych węzłów chłonnych (LLNA) (wymaga zastosowania zwierząt - myszy)

OECD i UE zaproponowały nowe metody oceny ostrej toksyczności, których ogólne założenia zawarte są w tzw. trzech R:

Idea 3R - reduce, replace, refine

• reduction - ograniczenie liczby zwierząt do badań do minimum

• refinement - zminimalizowanie cierpienia zwierząt poprzez zmianę i ulepszenie procedur badawczych

• replacement - zastąpienie badań na zwierzętach testami in vitro ,in sillico

TOKSYCZNOŚĆ OSTRA jest zdolnością substancji do wywołania efektu toksycznego u zwierząt, w tym również śmierci, po jej podaniu do organizmu w dawce jednorazowej lub w kilku dawkach w ciągu 24 godzin.

Miarą toksyczności ostrej jest tzw. medialna dawka śmiertelna (LD 50) lub medialne stężenie śmiertelne (LD50)

Ważnym elementem oceny toksyczności ostrej są również obserwacje klinicznych objawów zatrucia: ogólny stan zwierząt, ośrodkowy i obwodowy układ nerwowy, autonomiczny układ nerwowy, układ oddechowy, sercowo- naczyniowy, trawienny, moczowo-płciowy oraz skóry i błon śluzowych. Czas obserwacji 14 dni.

Toksyczność ostra doustna (LD50 p.o.):

-dożołądkowo, sondą - objętość podawanej substancji ok. 1% masy ciała;

szczury - roztwory wodne: 2ml/100g m.c.,

roztwory oleiste : 0,5ml/100g m.c.

- w postaci kapsułek - niegryzonie

Przy podawaniu dużych objętości przekraczających pojemność żołądka, dawkę podać w częściach w ciągu kilku godzin jednak nie dłużej niż w ciągu 24 godzin. Zwierzęta powinny być głodzone przez 16-20 godzin przed podaniem substancji i 2-3 godzin po podaniu

Toksyczność ostra skórna (LD50 derm.):

• najczęściej króliki i szczury - na nienaruszoną skórę grzbietu pozbawioną sierści

• powierzchnia - co najmniej 10% powierzchni całego ciała

• czas ekspozycji - 24 godziny

• substancje płynne - w postaci nie rozcieńczonej

• substancje stałe - zwilżyć wodą lub w postaci maści

• badaną substancję zabezpieczyć opatrunkiem

Toksycznośc inhalacyjna (LD50):

• substancje gazowe lub lotne ciecze, aerozole

• czas narażenia 4 godziny

• zwierzęta umieszcza się w dynamicznych komorach toksykologicznych - wymiana powietrza 8-15 razy /godzinę oraz stałe stężenie badanej substancji w powietrzu

• naraża się całe zwierzęta lub ich głowy

LD 50 i LC50 są wykorzystywane do celów klasyfikacji substancji chemicznych pod względem siły ostrego działania toksycznego

Klasa toksyczności LD50 doustnie, szczur (mg/kg)

Bardzo toksyczna < 25

Toksyczna 25-200

Szkodliwa 200-2000

Niesklasyfikowana < 2000

Klasyczna metoda wyznaczania LD₅₀ - procedura OECD 401 - 10gryzoni dla każdego poziomu dawkowania, minimum 3 poziomy - 30 zwierząt + 10 zwierząt kontrolnych. Liczba zwierząt 40

TESTY ALTERNATYWNE

Metoda ustalonej dawki

-1 etap testowanie dawki (5, 50, 500 lub 2000mg/kg m.c.- „dawka różnicująca”, czyli najwyższa dawka wywierająca działanie toksyczne) na pojedynczych zwierzętach (jednej płci, max 5 zwierząt)

- etap w oparciu o badania wstępne testuje się 1 wybraną dawkę (5 samców i 5 samic) a następnie jeżeli jest to konieczne stosuje się kolejną dawkę.

Liczba zwierząt 10-15

Metoda klas ostrej toksyczności:

- postępowanie etapowe - 3 zwierzęta jednej płci na każdym etapie

- dawka początkowa - 25 200 lub 2000mg/kg m.c.

- dawka powoduje śmierć 2-3 zwierząt - przerwanie badań, ta dawka jest podstawą klasyfikacji

- dawka powoduje śmierć 1 zwierzęcia lub nie uśmierca żadnego tę samą dawkę podać zwierzętom płci odmiennej - padły 2-3 - zatrzymanie doświadczenia

- jeżeli wszystkie przeżyły - kolejny etap na wyższym poziomie dawkowania

Liczba zwierząt 9-12

Metoda większej - mniejszej dawki (skokowej dawki)

- substancję podaje się pojedynczym zwierzętom w dawkach różniących się o stały współczynnik (na ogół 1.3) co 24 godziny

- jeżeli przeżyje - dawka wyższa, padnie - dawka niższa

- badania trwa do momentu jeśli zwierzę przeżyje 4 kolejne dawki

Liczba zwierząt 11

	Badanie działania mutagennego	Badanie działania kancerogennego	Badanie działania teratogennego
Metody tradycyjne	1 miesiąc	2 lata	4 miesiące
Metody alternatywne	1 dzień	2-6 tygodni	5 dni

TOKSYCZNOŚC KUMULACYJNA

- określa się dawkę kumulatywną C-LD₅₀ (wyraża się ją jako% A-LD₅₀)

- metoda podana przez Lima: 2 grupy zwierząt po 5 osobników, codziennie podaje się substancję badaną w dawce począwszy od 9% A-LD₅₀, która zwiększamy co 4 dni o iloczyn 1,5 aż do wywołania śmierci

Obliczenie współczynnika kumulacji

K_k =C-LD₅₀/A-LD₅₀

Porównanie C-LD₅₀ i LD0₅₀:

1. brak kumulacji - C-LD₅₀ jest zbliżone do LD₅₀

2. kumulacja - C-LD₅₀ jest niższe od LD₅₀

3. o tolerancji ksenobiotyków przez ustrój - C-LD₅₀ istotnie przekracza LD₅₀

Klasyfikacja K_k

Nadkumulacja <1

Silna kumulacja 1-3

Średnia kumulacja 3-5

Słaba kumulacja >5

TOKSYCZNOŚĆ PODOSTRA (krótkoterminowa, test 14- lub 28- dniowy, „test poszukiwania dawek”)

- jest zdolnością substancji chemicznej do wywołania zmian w organizmie zwierząt laboratoryjnych w warunkach narażenia powtarzanego codziennie w sposób przerywany (np. 8godz.) lub ciągły (24 godz.) przez okres 14 i 28 dni. Zmiany obserwuje się w trakcie i po narażeniu.

- stosowane są co najmniej 3 poziomy dawkowania (będące ułamkiem LD50 lub LC50)

• najwyższa - wywoła wyraźne objawy zatrucia

• najniższa nie spowoduje żadnych zmian (NOEL - poziom bez obserwowanego działania)

-jedna grupa- grupa kontrolna

CEL - określenie zależności dawka - efekt, oznaczenie NOEL oraz wskazanie narządów lub układów krytycznych dla badanych substancji w warunkach powtarzalnego narażenia (toksyczność układowa)

TOKSYCZNOŚĆ PODPRZEWLEKŁA (subchroniczna, test 90-dniowy)

- jest zdolnością substancji chemicznej do wywołania efektu toksycznego u zwierząt laboratoryjnych otrzymujących badaną substancję różnymi drogami w sposób przerywany lub ciągły, codziennie, 5 dni w tygodniu, przez okres 90 dni (ok. 10% długości życia gryzoni)

- obserwacja skutków działania substancji w czasie i po narażeniu

- co najmniej 3 poziomy dawkowania (ustalone w badaniach toksyczności podostrej)

- jedna grupa - grupa kontrolna

- zmiany ocenia się metodami i technikami biochemicznymi, enzymatycznymi, hematologicznymi, histochemicznymi, histoenzymatycznymi i ultrastrukturalnymi.

- badania obejmują: płyny ustrojowe, wydzieliny, wydaliny, większość narządów i układów

- badania - po 14, 28, 90 dniach

CEL - określenie dawka- efekt, ustalenie wartości NOEL oraz LOEL (najniższy obserwowany poziom działania)

Badania te potwierdzają lub wskazują, które narządy i układy ulegają uszkodzeniu. Pozwalają na prześledzenie sumowania się toksycznego działania substancji w warunkach powtarzalnego narażenia (tzw. kumulatywność)

TOKSYCZNOŚĆ PRZEWLEKŁA (test 2-letni)

- jest zdolnością substancji chemicznej do wywołania efektu toksycznego u zwierząt laboratoryjnych w warunkach narażenia przewlekłego, co najmniej 12 miesięcy.

- podawanie - różnymi drogami w sposób przerywany lub ciągły przez 5 dni w tygodniu

- dwa gatunki zwierząt obojga płci, z których jeden gatunek nie jest gryzoniem

- zakres badań - wskaźniki biochemiczne, enzymatyczne, hematologiczne, testy behawioralne, neurologiczne, elektrofizjologiczne, morfologiczne narządów i tkanek.

- dawki - ustalone w badaniach toksyczności podostrej

- czas wykonania badań - po 6, 12, 18, i 24 miesiącach

CEL - ustalenie zależności dawka- efekt po przewlekłym narażeniu, określenie wartości NOEL, określenie narządów krytycznych, poznanie mechanizmów toksycznego działania badanej substancji. Normowanie wartości NDS, ADI, DSB

ADI - akceptowane dzienne pobranie; dopuszczalne poziomy substancji w żywności lub wodzie do picia

NDS - najwyższe dopuszczalne stężenie w powietrzu - jest to średnie stężenie substancji, którego oddziaływanie na pracownika w ciągu 8- godzinnego dobowego i 42- godzinnego tygodniowego wymiaru czasu pracy przez okres jego aktywności zawodowej nie powinno spowodować ujemnych zmian w jego stanie zdrowia oraz zdrowia jego przyszłych pokoleń

DSB - dopuszczalne stężenie biologiczne; stężenie przy którym w czasie długotrwałego narażenia nie powinno wywołać skutków szkodliwych; odnosi się do substancji macierzystych lub metabolitów sub, toksycznych obecnych we krwi, moczu, powietrzu; umożliwia bezpośrednią ocenę ryzyka wystąpienia skutków narażenia na substancje toksyczne

NDSCh - najwyższe dopuszczalne stężenie chwilowe - jest wartością średnią, która nie powinna spowodować ujemnych zmian w stanie zdrowia pracownika oraz stanie zdrowia jego przyszłych pokoleń, jeżeli utrzymuje się w środowisku pracy nie dłużej niż 30 minut w czasie zmiany roboczej.

NDSP - najwyższe stężenie pułapowe - jest wartością, które ze względu na zagrożenie zdrowia lub życia pracownika nie może być przekroczona w środowisku pracy w żadnym momencie (wartości NDSP dotyczą substancji silnie drażniących i blokujących oddychanie tkankowe)

DZIAŁANIE RAKOTWÓRCZE

- doświadczalna ocena działania rakotwórczego przy użyciu długoterminowych doświadczeń.

CEL - identyfikacja w stosunkowo krótkim czasie, ze względu na krótki czas życia zwierząt, substancji potencjalnie rakotwórczych dla człowieka. Poznanie działania rakotwórczego i mechanizmu procesu nowotworowego.

- zwierzęta - co najmniej dwa gatunki zwierząt obojga płci (jeden nie będący gryzoniem): najczęściej szczury, myszy, chomiki syryjskie

- wiek - 4-5 tygodniowe pochodzące od rodziców otrzymujących przez 2 miesiące przed kojarzeniem paszę z dodatkiem badanej substancji

- czas narażenia - ok. 2 lata szczury, 18 miesięcy myszy

- droga podania - pokarmowa -pasza, woda do picia (2-3 razy tygodniowo), podskórnie lub dożylnie - 1-2 razy tygodniowo, na skórę - codziennie

DZIAŁANIE MUTAGENNE

- testy krótkoterminowe (przesiewowe) służą do oceny właściwości genotoksycznych substancji chemicznych

Ocena:

• mutacji genowych (punktowych)

• mutacji chromosomowych (aberracji strukturalnych)

• mutacji genomowych (aberracji chromosomów)

- modele badawcze: bakterie, grzyby, drożdże, muszka owocowa, komórki ssaków, zwierzęta

TEST AMESA (test salmonellowo-histydynowy) - test mutacji powrotnych, szczepu bakterii Salmonella typhimurium (mutanty, które utraciły zdolność syntezy histydyny w wyniku mutacji pierwotnych); w wyniku działania substancji genotoksycznych dochodzi do mutacji powrotnych (odzyskanie zdolności syntezy histydyny i możliwości rozmnażania się na podłożu bez tego aminokwasu)

DZIAŁANIE TERATOGENNE

CEL - określenie wpływu badanego ksenobiotyku na zarodek w czasie organogenezy; poszukiwanie wad rozwojowych natury strukturalnej i funkcjonalnej; znalezienie dawki nieefektywnej i dawki minimalnej efektywnej.

- zwierzęta: szczury, chomiki, króliki

- dawki: duża rozpiętość : 1/5, 1/50, 1/250 LD50

- sposób podania : z paszą, wodą lub zgłębnikiem do żołądka w czasie organogenezy (u szczurów 6-15 tydzień ciąży)

- badany materiał: płody uzyskane podczas cięcia cesrskiego 1-2 dni przed porodem (u 60% samic); część rodzi - obserwacja młodych przez 3 miesiące

- pomiary i obserwacje:

• masa ciała samic w 1, 6, 15, i 21 dniu ciąży;

• kontrola spożycia paszy i wody;

• liczba resorpcji wczesnych i późnych;

• liczba płodów żywych i martwych;

• liczba ciałek żółtych;

• wygląd łożyska

• płody - płeć

• masa ciała

• badanie układu kostno-szkieletowego, narządów wewnętrznych

BADANIE WPŁYWU NA PŁODNOŚĆ, ROZRODCZOŚĆ I POTOMSTWO

CEL- wpływ ksenobiotyków na czynność gruczołów płciowych; cykl rujowy, kojarzenie, na zapłodnienie, przebieg ciąży, poród

- badania prowadzi się na młodych szczurach u trzech pokoleń zwierząt

- badane grupy zwierząt otrzymują przez 2 miesiące paszę z dodatkiem substancji

- kojarzenie (2 samice+1 samiec - pokolenie wyjściowe Fo)

- zakres badań:

• kontrola spożycia paszy i wody

• zwiększenie masy ciała

• rejestracja śmiertelności zwierząt

• % zapłodnień i okres trwania ciąży

• badanie płodów z ostatniego pokolenia

• uśpione zwierzęta: ocena makroskopowa i mikroskopowa narządów

BADANIE DZIAŁANIA NEUROTOKSYCZNEGO

CEL- określenie opóźnionego neurotoksycznego działania w zatruciu ostrym i ustalenie dawki, która nie powoduje reakcji neurotoksycznych w badaniu podostrym i przewlekłym

Przyczyny zmian w OUN:

• niedotlenienie - tlenek węgla

• uszkodzenie osłonki mielinowej - ołów

• uszkodzenie aksonów - etanol, dwusiarczek węgla

• uszkodzenie komórek nerwów obwodowych - organiczne związki rtęci

• paraliż mięsni szkieletowych - botulina

• uszkodzenie kory mózgowej - metylortęć

- zwierzęta: 1,5 -roczne kury białe rasy Leghorn

- droga podania: dożołądkowo przez sondę

- dawki: 3 zakresy określone w badaniach pilotowych; grupa kontrolna i wprowadza się tzw. grupę pozytywną (otrzymuje np. leptofos lub fosforan tiortokrezylu)

- czas ekspozycji: w badaniach działania ostrego - 3 dni, obserwacja przez 3 tygodnie

w badaniach podostrych - 90 dni narażenia

badania przewlekłe - narażenie przez rok

- zakres badań: kontrola spożycia paszy i wody

zwiększenie masy ciała

wygląd kur i ich zachowanie

zachorowalność i umieralność

obserwacja objawów neurotoksycznych - niedowłady, bezwłady, porażenie, zaburzenie wrażliwości

- po zakończeniu ekspozycji: badania histopatologiczne - nerw kulszowy, mózg, móżdżek, rdzeń kręgowy i przedłużony, mięśnie szkieletowe uda, dodatkowe - oznaczenie aktywności esterazy cholinowej we krwi

DZIAŁANIE DRAŻNIĄCE

- skóra (grzbiet, ogolony) królika

- ilość substancji badanej - 0,5 ml cieczy lub 500 mg ciała stałego - na skórę i zabezpieczenie opatrunkiem

- czas ekspozycji - 4 lub 24 godziny,

- odczyt wyników po 1, 24, 48 i 72 godzinach po usunięciu substancji z powierzchni skóry

- ocena: intensywności rumienia i obrzęku za pomocą umiarkowanej skali punktowej

zmiany skórne - wysuszenie, pękanie, łuszczenie naskórka

- uzyskane wyniki - obliczenie indeksu działania drażniącego na skórę (IDD)

- nie bada się: mocnych elektrolitów (pH= 2-11,5), substancji silnie toksycznych po podaniu na skórę (LD50 derm. Poniżej 500mg/kg m.c.)

- oko królika - do worka spojówkowego 0,1 ml substancji ciekłej lub sproszkowanej substancji stałej (100 mg); drugie oko - kontrola;

- ocena zmian po 1, 24, 48, 168 godz. po podaniu badanej substancji; określa się indeks działania drażniącego (IDDO)

DZIAŁANIE UCZULAJĄCE

- jest to zdolność substancji chemicznych do wywołania reakcji immunologicznych w przypadku bezpośredniego kontaktu za skórą lub błonami śluzowymi

- zwierzęta: dorosłe, młode świnki morskie jednej płci, na ogół samce

- droga: śródskórna i na skórę

- dawka: ustalona w badaniach wstępnych dawka i stężenie substancji - dawka śródskórna nie dająca innych objawów poza rumieniem oraz stężenie roztworu, który po naniesieniu na skórę nie działa drażniąco

Wyróżniamy:

- fazę indukcji uczulenia - wstrzyknięcie śródskórne w okolicy grzbietu (bez sierści) roztworu substancji; po tygodniu na skórę w te same miejsce nanosi się substancję na okres 48 godz.

- fazę wywołania uczulenia (test sprawdzający) - po dalszych 2 tygodniach badaną substancję nanosi się na boki zwierząt pozbawione sierści (test płatkowy) i zabezpiecza się opatrunkiem na 24 godziny.

- ocena: intensywność rumienia i obrzęku; określa się siłę działania uczulającego za pomocą odsetka zwierząt wykazujących dodatnią reakcję alergiczną.

---