Metabolizm centralny i peryferyjny Bioprodukty powstające podczas hodowli m-org są metabolitami czyli związkami ściśle związanymi funkcjami życiowymi komórki. Metabolit definiowany jest jako związek organiczny bądź nieorganiczny produkowany przez komórki. Przyjęto jednak że określenie to nie dotyczy białek i kwasów nukleinowych. Mówiąc o metabolitach myśli się raczej o substancjach niskocząsteczkowych. Określenie to nie jest ścisłe ponieważ enzymy z jednej strony są białkami i substancjami o stosunkowo dużym ciężarze cząsteczkowym, a są jak najbardziej metabolitami. Przyjęto również stosowanie dwóch terminów: metabolizm centralny i peryferyjny (pierwotny i wtórny; pierwszo- i drugorzędowy). Metabolizm centralny- to zespół przemian odbywający się u wszystkich organizmów żywych i związany bezpośrednio z realizacją funkcji życiowych organizmu. Są to takie przemiany jak: przyswajanie źródła węgla, azotu, oddychanie, wydzielanie CO2, przemiany w warunkach beztlenowych tj. produkcja etanolu czy kwasu mlekowego. Metabolizm peryferyjny- jest bardziej różnorodny charakterystyczny dla danego organizmu i produkty tych przemian są bardziej różnorodne. Typowymi produktami metabolizmu peryferyjnego są antybiotyki, insektycydy, hormony, kauczuk naturalny, inhibitory enzymów. Anabolizm i katabolizm Anabolizm to inaczej reakcje syntez odbywające się w komórce w wyniku których następuje tworzenie związków bardziej złożonych i reakcje te wymagają dostarczenia energii przykładem takich reakcji jest fotosynteza, chemosynteza, biosynteza białek, lipidów, kwasów nukleinowych. Reakcje anaboliczne kumulują energię, a powstające produkty zawierające więcej energii niż substraty które brały udział w tej syntezie. Katabolizm to inaczej reakcja rozkładu, degradacja związków złożonych bogatych w energię. Tworzeniu związków prostszych towarzyszy uwalnianie energii i przykładami tych reakcji są: oddychanie, fermentacja (etanol, kwas mlekowy) i utworzone produkty mają mniej energii niż substraty. Reakcje metaboliczne zachodzące w komórkach podlegają złożonym mechanizmom kontrolnym i odbywa się to zwykle poprzez regulację określonych aktywności enzymów. Charakterystyczne jest również że produkty metabolizmu centralnego tworzone są w fazie wzrostu wykładniczego a produkty peryferyjne w fazie stacjonarnej która jest określana terminem idiofaza, a produkty metabolizmu peryferyjnego - idiolity. Przemianami charakterystycznymi dla metabolizmu centralnego są: glikoliza (szlak heksozomonofosforanowy), cykl Crebsa, droga Entnera- Daudorowa. Mikroorganizmy spalają glukozę najczęściej wg szlaku EDP po czym w zależności od warunków tlenowych (bądź ograniczonego natlenienia). Tworzony w ramach glikolizy kwas pirogronowy zostaje przekształcony do acetloCoA i kierowany do cyklu Krebsa- warunki tlenowe. W warunkach ograniczonego natlenienia ujawnia się metabolizm beztlenowy i dochodzi tam do fermentacji czyli tworzenia takich produktów jak kwas mlekowy, propionowy, etanol, CO2. W zależności od dostępu tlenu zysk energetyczny tych przemian będzie różny ponieważ w ramach glikolizy w warunkach tlenowych powstaje 38 cząsteczek ATP a w warunkach beztlenowych jedynie 2 cząsteczki ATP. Tak więc warunki natlenienia mają zasadniczy wpływ na wzrost i tworzenie metabolitów przez dany mikroorganizm. Porównanie wzrostu drożdży Sacharomyces cerevisiae w warunkach tlenowych i beztlenowych. Głównymi szlakami funkcjonującymi w ramach metabolizmu centralnego są: glikoliza, szlak HMP, ED (Entnera- Daudoroffa) i szlaki anaplerotyczne (wspomagające). Zasadniczym szlakiem degradacji glukozy jest droga EMP. Reakcją najbardziej charakterystyczną dlatego szlaku jest podwójne ufosforylowanie cząstek heksozy z wytworzeniem fruktozo 1,6-difosforanu. Związek ten ulega następnie rozbiciu ba dwie triozy- na dwie części kwasu pirogronowego. W warunkach tlenowych część pirogronianu ulega dekarboksylacji i powstaje acetyloCoA i zostaje włączona do cyklu Krebsa po czym pośredniki trafiają do układu oddechowego. W warunkach beztlenowych pirogronian zostaje zredukowany do produktów fermentacji tj: kwas mlekowy w ramach tych przemian powstać może również etanol, kwas pirogronowy, bursztynowy, aceton, diacetyn, butanodiol. Tak więc w zależności od dostępu tlenu uzyskuje się dwie różne grupy produktów: - produkty fermentacji - (w wyniku oddziaływania cyklu Krebsa) - kwasy organiczne, aminokwasy. Ponieważ glikoliza dostarcza komórce głównie związków trój węglowych, w związku z tym może wystąpić deficyt związków czterowęglowych. W takiej sytuacji uaktywniają się reakcje wspomagania powodujące karboksylację pirogronianu i fosfoendopirogronianu do szczawiooctanu. Dzięki temu z pełną aktywnością może zachodzić cykl Krebsa i jednocześnie uaktywniony zostaje układ oddechowy. W tej sytuacji można sądzić że zwiększy to produkcję aminokwasów i parafin, ponieważ będą duże ilości bursztynyloCoA. Cykl HMP Z punktu widzenia biotechnologii ważne jest czy dany szczep posiada zdolności asymilacji heksoz w ramach szlaku HMP. Glukoza w tym szlaku utleniana jest do 6-fosfoglukonianu po czym związek ten ulega dekarboksylacji tworząc rybulozo-6-P. W dalszych etapach szlaku powstają Metody skriningu mikroorganizmów przemysłowych Mikroorganizmy bytujące w przyrodzie charakteryzują się zrównoważonym, zbilansowanym metabolizmem i nie dochodzi tam do nadprodukcji metabolitów. Szczepy takie nie kwalifikują się do tego by być wykorzystane w procesach biosyntezy, w których ilość wydzielanego metabolitu stanowi podstawowe kryterium oceny szczepy. Mikroorganizmy pozyskane ze środowiska przyrodniczego są badane pod kątem określonych aktywności, klasyfikowane w grupach i np. ewentualnie przydatne dla biotechnologii. Szczepy te poddawane są zabiegom doskonalenia cech: mutagenizacji i rekombinacji genetycznej. Obie te metody są stosowane często, interesujące mutanty są wykorzystywane w manipulacjach genetycznych. Szacuje się, że aktualnie ok. 40% szczepów wykorzystywanych przemysłowo to rekombinaty genetyczne. Zarówno podczas procesów mutagenizacji jak i rekombinacji genetycznej dużym problemem jest znalezienie w populacji poddanej doskonaleniu klonów o udoskonalonych cechach. Celem jest opracowanie odpowiednich kryteriów skriningu mieszanimy komórek po zabiegu doskonalenia. Skrining definiowany jest jako kompleksowe postępowanie obejmujące zespół selektywnych zabiegów mających na celu wykrycie i wyizolowanie spośród dużej liczby mikroorganizmów tylko tych, które są celem badań. Skrining obejmuje również określenie, opis danego szczepu na podstawie którego można tę kulturę klasyfikować jako przydatną dla biotechnologii. Metody skriningu podzielono na 2 grupy: - skrining losowy - skrining racjonalny Klasyczną formą skriningu jest rozsiew populacji na płytki Petriego na podłoże stałe. Daje to możliwość uzyskania monokultur i sprawdzenia aktywności tych monokultur w hodowlach w podłożu płynnym. Przy poszukiwaniu szczepów o zmienionej aktywności metabolicznej, a nie różniących się morfologicznie jest to postępowanie bardzo pracochłonne, przy braku szczęścia- nieefektywne. Tę formę skriningu na etapie rozsiewu na płytki jak i sprawdzanie wybranych aktywności w podłożu płynnym określa się jako skrining losowy. W ramach tej formy skriningu udają się jednak zastosować pewne ułatwienia: 1) zastosowanie barwnych substratów 2) zastosowane odpowiednich wskaźników W przypadku poszukiwnia klonów o podwyższonej aktywności amylolitycznej dodaje się do podłoża wzrostowego skrobię i wielkość stref rozjaśnienia podłoża wokół wybranych kolonii informować będzie o poziomie aktywności amylolitycznych monokultur. Podobnie stosując w podłożu jako źródła C i N, kazeinę można wyodrębnić monokultury produkujące zwiększone ilości enzymów proteolitycznych. Kazeina daje opalescencję mleczną, po nałożeniu enzymu podłoże wokół hodowli staje się bardziej klarowne. Na użytek tych badań produkuje się substancje barwne np. starch azure, blue starch, blue celluloze, blue dextran. Te barwne substraty są praktycznie przydatne jedyne w początkowej fazie doskonalenia szczepów. W późniejszych etapach gdy wydajności są bardzi wysokie różnice wielkości stref rozjaśnienia są praktycznie niezauważalne. Mankamentem tej formy skriningu jest to, że wielkość strefy pozostaje funkcją szybkości wzrostu kolonii i jej średnicy. Metody uaktywniania mechanizmów naprawczych po mutagenizacji/ rekombinacji. W przypadku stosowania mutagenów chemicznych zaraz po zakończeniu traktowania komórek mutagenem (od 30 do 60 min) komórki odwirowujemy, zawieszamy w świeżym podłożu hodowlanym, inkubujemy kilkanaście godzin w przypadku bakterii, koło 30 godzin w przypadku zarodników grzybów strzępkowych. Podczas tej hodowli namnażają się komórki o niezmienionym genomie, giną komórki u których genom został uszkodzony na tyle, że nie mogły się namnożyć oraz wzrosła ilość komórek w których uaktywnione zostały mechanizmy naprawcze i powstały u komórki o zmienionych cechach. Namnożenie tych komórek powoduje zwiększenie ich udziału w populacji a tym samym ułatwia ich wyizolowanie podczas skriningu (rozsiewu na płytki). W przypadku stosowania mutagenów fizycznych np. promienie UV komórki poddane ekspozycji napromieniowania po odłączeniu promiennika umieszcza się w ciemności. Światło dzienne powoduje bowiem zniesienie uszkodzeń wywoływanych przez promienie UV, bez dostępu światła w komórce uaktywniają się mechanizmy naprawcze. To trzymanie komórek w ciemności trwać powinno 5-8 h. po tym czasie kulturę możemy namnażać w podłożu płynnych dla zwiększenia udziału komórek o zmienionym genomie lub bezpośrednio kierować do rozsiewu. W przypadku manipulacji genetycznych główna uwaga skierowana jest na ochronę materiału genetycznego by manipulacje te odbywały się w warunkach optymalnych dla samej cząsteczki DNA, stosowanych wektorów i enzymów (głównie restrykcyjnych). Procedura racjonalnego skriningu jest podobna do postępowania w ramach skriningu losowego z tym że racjonalna jego forma prowadzona jest w warunkach, które ograniczają wzrost niepożądanych kultur lub limitują ujawnienie się cech niekorzystnych a tym samym ułatwiają selekcję mutantów pozytywnych. Metody racjonalnego skriningu podzielona na dwie grupy: - metody bezpośrednie - metody pośrednie W metodach bezpośrednich analizowana jest aktywność, która jest przedmiotem naszego zainteresowania. Natomiast w metodach pośrednich jako pierwszą oceniamy właściwość (wybraną przez nas) i po dokonaniu tej oceny sprawdzamy dla wybranej grupy monokultur- aktywność docelową. Najważniejsze metody pośrednie racjonalnego skriningu 1) detekcja auksotrofii / detekcja rewersji auksotrofii 2) poszukiwanie mutantów konstytucyjnych 3) skrining w kierunku obniżenia inhibicji

związki 4 i 7-węglowe. Uzupełniając tym samym szkielety węglowe do syntezy różnych składników biomasy. Szlak ten jest bardzo ważny z punktu widzenia obiegu węgla w przyrodzie. Związany jest z rozkładem substancji celulozowej z technologicznego punktu widzenia daje szanse wykorzystania tego typu surowców w podłożu hodowlanym. Szlak Entnera- Daudoroffa Szlak ED w pierwszej fazie przebiega podobnie jak szlak HMP czyli utworzony zostaje 6-fosfoglkonian, który po przekształceniu do 2-oksy-3-deoksy-6-fosfoglukonianu zostaje rozbity na dwie triozy, pirogronian i aldehyd 3-fosfoglicerynowy. Od tego momentu przemiany idą według szlaku EMP. Szlak ten jest charakterystyczny dla takich bakterii jak: Pseudomonas, Acetobacter, Gliconobacter i szlak ten dostarcza komórce pośredników do biosyntezy nukleotydów. Mikroorganizmy oprócz metabolitów niezbędnych dla własnego rozwoju mogą wytwarzać produkty, które nie spełniają funkcji metabolicznych. Produkty te określa się terminami metabolity specyficzne, bądź idiolity ponieważ powstają w idiofazie. Produkty te stanowią przedmiot ogromnego zainteresowania biotechnologii ze względu na swoje szczególne właściwości, np. są to substancje o właściwościach anabolicznych, cytotoksyczne, hemolityczne, herbicydowe, immunostymulujące, przeciwdrobnoustrojowe, przeciwinsekcytydowe, przeciwnowotworowe, przeciwzapalne, uspokajające, rakotwórcze. Pod względem chemicznym idiolity są to: alkaloidy, aminocukry, chinony, fenazyny, antocyjaniny, flawonoidy, nitryle, piperazyny, peptydy, pirydyny, pirole, polieny, steroidy, tetracykliny. 1) Metabolizm peryferyjny stanowi cechę szczególną danego szczepu i w produkcji idiolitów królują promieniowce, grzyby strzępkowe i w mniejszym stopniu bakterie. 2) ten sam szczep może wytwarzać równocześnie kilka idiolitów należących do różnych grup związków chemicznych. 3) produkcja idiolitów uzależniona jest od warunków hodowli, od składu podłoża i ich synteza rozpoczyna się zwykle po wykorzystaniu głównej puli źródła C, N i P czyli po wyczerpaniu głównych składników odżywczych. Cecha ta powoduje że możemy w dużym stopniu regulować tworzenie tych metabolitów. Rola idiolitów w przyrodzie. I ekologiczna- antybiotyki wywarzane w glebie (promieniowce, grzyby strzępkowe) II zmiana rodzaju przemian zachodzących w komórce mające na celu zapewnienie komórce w sytuacji gdy nie ma możliwości namnażania się biomasy utrzymania jej aktywności metabolicznej i co równie ważne stanu równowagi z otoczenia. III wolna gra ewolucyjna- procesy ewolucyjne zachodzące w sposób uporządkowany. Biosynteza metabolitów specyficznych jest ściśle powiązana z centralnymi szlakami degradacyjnymi i podstawowymi syntezami komórkowymi. Podstawowymi prekursorami do syntez peryferyjnych są ufosforylowane cukry, fosfoenolopirogronian, acetyloCoA, malonyloCoA. Szlak poliketydowy jest zwielokrotnieniem reakcji zachodzących przy syntezie tłuszczów. Enzymy funkcjonujące w ramach metabolizmu peryferyjnego charakteryzują się niska specyficznością substratową. Dzięki temu powstać mogą związki różnorodne pod względem chemicznym, wiele związków pokrewnych i synteza tych substancji może być precyzyjnie regulowana. Regulacja syntezy idiolitów 1) Produkcja idioliów rozpoczyna się w momencie wyczerpania możliwości wzrostu komórki. Mechanizmy regulujące syntezę idiolitów: - indukcja substratowa- np. produkcja cefalosporyny przez szczepy Cephalosporium rozpoczyna się w momencie nagromadzenia w podłożu i w komórkach metioniny (zewnętrzny efektor) i D,L-cysteiny - indukcja metaboliczna- mamy tu do czynienia z wewnętrznym efektorem metabolizmu w którym w przypadku szczepów Streptomyces jest tzw. czynnik A. - regulacja kataboliczna- chodzi o ograniczenie ilości łatwo przyswajalnego źródła C np. glukoza. Obecność glukozy w dużym stężeniu ogranicza syntezę penicyliny. - regulacja źródłem azotu (azotowa represja kataboliczna )- obecność łatwo przyswajalnych jonów amonowych ogranicza syntezę penicyliny. - regulacja źródłem fosforu- nadmiar jonów fosforanowych ogranicza syntezę Streptomycyny przez szczepy Streptomyces - regulacja na zasadzie sprzężenia zwrotnego- pewne metabolity centralne mogą ograniczać syntezę metabolitów i tak obecność L-lizyny może ograniczać syntezę penicyliny. Produkcja aminokwasów Aminokwasy reprezentują ważną grupę pierwotnych metabolitów znajdujących wykorzystanie w przemysłach: spożywczym, paszowym, farmaceutycznym, kosmetycznym i chemicznym. Aktualna światowa produkcja aminokwasu przekracza 2,5 mln ton rocznie. Wartość sprzedaży aminokwasu przekroczyła w 2004 roku 4,5 biliona dolarów i wykazuje stałą tendencję wzrostową wynoszącą od 5-10% rocznie. Największy udział w sumarycznej produkcji aminokwasów mają tzw. aminokwasy paszowe: L-lizyna, D,L-metionina, L-treonina i L-tryptofan. Udział ten wynosi 56%. Pod względem wielkości produkcji produkcji aminokwasu poczesne miejsce zajmuje kwas L-glutaminowy (ok. mln ton rocznie) kolejna lokata przypada L-lizynie (ok. 450 tys ton rocznie). Głównym odbiorcom kwasu L-glutaminowego jest przemysł spożywczy. Wynika to z faktu, że glutaminian sodu dodawany do potraw w ilości 0,1-0,4% wzmaga ich smakowitość, a sam wywołuje wrażenie smakowe określone jako umami.innymi przykładami zastosowania aminokwasów w żywności są L-asparaginian i L-fenyloalanina, stosowane do produkcji składników oraz L-glicyna, dodawana do słodzików w celu zamaskowania posmaku sacharyny. Dominującym aminokwasem w przemyśle paszowym jest L-lizyna (w celu wyeliminowania niedoboru tego aminokwasu w białkach roślinnych), L-tryptofan jako czynnik antydepresyjny. produktem końcowym 4) skrining w kierunku obniżenia katabolicznej represji 5) skrining w kierunku zwiększenia oporności w stosunku do toksycznych analogów związków pośrednich metabolizmu 6) wzrost aktywności detoksykacyjnej 7) obniżenie na wybrane składniki pożywek lub prekursory 8) relekcja mutantów o korzystnej morfologii 9) relekcja mutantów o zwiększonej przepuszczalności ściany komórkowej Poszukiwanie mutantów konstytucyjnych Terminem mutanty konstytutywne określa się szczepy, które produkują określone enzymy niezależne od obecności induktora tej syntezy w podłożu. Wydajności produkcji enzymów indukowanych są zwykle o wiele niższe od tych uzyskiwanych przez szczepy konstytutywne P: produkcja α-amylazy, którą początkowo produkowano na podłożach zawierających skrobię. Lata 60 i 70 dzięki zastosowaniu mutantów konstytutywnych przyniosły ogromny wzrost produkcji α-amylazy. Dziś rolę induktorów produkcji tego enzymu mogą pełnić dodane w bardzo niewielkich ilościach wybrane maltodekstryny, maltotrioza, maltotetraoza. Podstawową metodą stosowaną w poszukiwaniu mutantów konstytutywnych jest hodowla ciągła w warunkach chemostatu. Hodowla obejmuje etapy: 1) kilkunastogodzinna hodowla w fermentor ku populacji poddanej wcześniej mutagenizacji (podczas tej hodowli dzięki mechanizmom naprawczym namnażają się komórki trwale zmutowane) 2) etap hodowli z ciągłym dozowaniem podłoża zawierającym indukujący substrat w bardzo niskim stężeniu 3) kontrola wybranej aktywności (np. cykl amylazy) w odstępach 2-4 godzinnych jeżeli wśród wyhodowanych komórek są mutanty konstytutywne to podczas hodowli ciągłej następuje moment, w którym zaobserwowano podwyższenie wydajności syntezy α-amylazy. W tym momencie należy pobrać próbki zawiesiny hodowlanej i dokonać rozsiewu na płytki ze stałym podłożem zawierającym substrat również w niewielkim stężeniu. Jeżeli nie będzie możliwe zaobserwowanie stref rozjaśnienia wokół kolonii metodą stempla przenosimy materiał biologiczny na kolejna płytkę, w której substrat ten występuje w wyższym stężeniu. Drugą taką metodą stosowaną do wyizolowania mutantów konstytutywnych jest stosowane w podłożu selekcyjnym związki o strukturze podobnej do substratu. Związki te określa się terminem analogi. W przypadku skrobii analogami są amylopektyna czy glikogen. Stymulatorami biosyntezy α-amylazy mogą być również dodane w bardzo niskich stężeniach maltodekstryny, maltotriozy, maltotetraoza, czasem laktoza. 1) auksotrofia W badaniach skriningowych populacji szczególną uwagę zwraca się na mutanty auksotroficzne- szczepy nie posiadające konkretnego enzymu w szlaku przemian aminokwasów. Mutacje auksotroficzne w centralnym szlaku mogą dostarczać pośrednie substraty dla syntez metabolitów centralnych jak i peryferyjnych. Auksotrofia powoduje: - konieczność wprowadzania do podłoża aminokwasu, który nie może być syntetyzowany w komórce - że występujące wcześniej w szlaku aminokwasy gromadzone są w podłożu (produkcja lizyny, argininy) - auksotrofia sprzyja wykształceniu szlaków pobocznych - z tego względu mutanty auksotroficzne poddaje się często ponownej mutagenizacji, szczep staje sie ponownie prototrofem, ale już z wykorzystaniem innych szlaków metabolicznych. Do syntezy ważnych z przemysłowego punktu widzenia aminokwasów lizyny, kwasu glutaminowego i argininy wykorzystuje się homoserynozależne mutanty bakterii Corynebacterium i Breviobacterium. I ta ich auksotrofia polega na tym, że one nie urosną bez obecności homoseryny w podłożu. Wpływ mutacji auksotroficznych na produkcję metabolitów specyficznych jest często trudny do wyjaśnienia. Częściej jest tak, że auksotrofia powoduje obniżenie syntezy metabolitów peryferyjnych. Jednak auksotrofy lizynowe uznawane SA aktualnie za bardzo cenne dla produkcji penicyliny. Skrining w kierunku wykrycia auksotrofii może również prowadzić do wyeliminowania niepożądanych odgałęzień szlaków metabolicznych, zniesienia mechanizmów represji katabolicznej, sprzężenia zwrotnego. Zainteresowanie rewertantami auksotrofów zapoczątkowało uzyskanie szczepów Streptomyces (rewetantów) produkujących z bardzo wysoka wydajnością aktynomycynę. Podstawową metodą służącą do wykrywania mutantów auksotroficznych jest metoda welwetowego. Przygotowuje się kilka serii podłoży stałych, część z nich zawiera pełen zestaw aminokwasów, do kolejnych podłoży nie dodaje się wybranych aminokwasów. Przeszczepienie kultur z podłoża pełnego metodą stempla na pozostałe podłoża pozwala wykryć mutanty auksotroficzne. 3) selekcja mutantów niepodlegających inhibicji produktem końcowym Zastosowanie tej formy skriningu wykorzystuje obecność produktu w pożywce selektywnej o odpowiednio wysokim stężeniu stanowi użyteczną formę skriningu, jednakże może to prowadzić do selekcji mutantów wykazujących zdolność do wykorzystywania produktów do źródła węgla i azotu. Korzystniejszą formą skriningu jest dodawanie do podłoża selekcyjnego analogu produktu, związku trudniej metabolizowanego bądź całkowicie obcego dla metabolizmu. Związek ten jest rozpoznawany jako główny produkt, jednakże nie jest metabolizowany. Doświadczenia te wykonuje się najczęściej w warunkach chemostatu. Te formy skriningu doprowadziły do zwiększenia wydajności produkcji nystatyny i penicyliny przez szczepy Streptomyces i penicyliny. 4) selekcja w kierunku ograniczenia wpływu katabolicznej represji. Celem tego typu selekcji jest wyizolowanie mutantów zachowujących zdolność do syntezy

Najbardziej znanymi producentami kwasu są przedsiębiorstwa japońskie, koreańskie, amerykańskie, niemieckie (Degussa, Basf). Metody otrzymywania aminokwasów: 1) synteza chemiczna- pozwala otrzymywać wyłącznie formy D, L aminokwasów, co stwarza problem rozdziału powstającej mieszaniny do enancjomerów. Znalazła ona zastosowanie głównie w produkcji D,L-mtioniny (350 tys ton/rok) 2) biotransformacja (synteza enzymatyczna)- metodą enzymatyczną otrzymuje się przede wszystkim kwas L-asparaginowy oraz L-tryptofan 3) biosynteza (fermentacja)- jest najpowszechniej stosowanym sposobem otrzymywania aminokwasów. Tą metodą otrzymywane są kwas L-glutaminowy i L-lizyna. Technologia otrzymywania L- aminokwasu metodą fermentacji (mikrobiologiczną, biosyntezy) Aktualnie produkcja kwasu L-glutaminowego jest niemal w całości realizowana metodą fermentacji (biosyntezy) Szczepy produkcyjne- stosowane w produkcji kwasu L- glutaminowego - Corynebacterium glutaminum Są to bakterie gram +, nie wytwarzają przetrwalników i nie wykazują zdolności do ruchu. Mogą one rosnąć w postaci krótkich pałeczek o dł. 0,5-1µm lub w formie nitkowatych pałeczek o dł. 1,5-5µm. mogą rosnąć w warunkach tlenowych oraz beztlenowych. Bakterie te wykorzystują jako źródło węgla węglany (glukoza, sacharoza) kwasy organiczne ( octowy) i alkohole (etanol). Bakterie te nie wykazują aktywności amylolitycznej (nie rozkładają skrobii) celulolitycznych i proteolitycznej. Wszystkie szczepy CBG wykazują auksotrofię względem biotyny (nie syntetyzują biotyny) niektóre wymagają dodatkowo tlenu, tiaminy B1. Ich wspólną cechą jest zdolność do sekrecji kw glutaminowego w środowisku o niskim stężeniu biotyny. Biosynteza i uwarunkowania CG do produkcji kwasu glutaminowego Glukoza(szlak pentozowy, glukoza rozkładana w wyniku glikolizy)cykl Krebsa i kw dioksalowego(reakcje anaplerotyczne uzupełniające cykl Krebsa, kwas szczawiooctowy) L-glutaminian Bakterie CB posiadają aktywną dehydrogenazę glutaminianową i mało aktywną, nietrwałą labilną drugą dehydrogenazę oksoglutaminianową. Wspólny dla obydwu enzymów prekursor 2 oksoglutaran jest preferencyjnie przekształcany do kwasu glutaminowego. Reakcja ta katalizowana jest przez dehydrogenazę glutaminową wymagającą do swojego funkcjonowania obecność nad pH. Koenzym nad dostarczany jest w dużych ilościach przez szlak pentozowy a także w wyniku utleniania izocytynianu i szczawiooctanu. dużych ilości szczawiooctanu potrzebnego do syntezy 2 oksoglutaranu i kw glutaminowego dostarczają reakcje anaplerotyczne. Najważniejszymi enzymami anaplerotycznymi są karboksylazy pirogronianowa i fosfoenolopirogronianowa. Bakterie CB charakteryzują się wysoką aktywnością ureazyn (mocznik do amoniaku). Jony amonowe wprowadzana są do komórki na drodze dyfuzji a przy niskim stężeniu jonów w podłożu za pośrednictwem nośnika. Pierwotnym biorcą NH4+ jest 2 oksoglutaran który przekształcany jest do kwasu glutaminowego i glutaranu. W procesie włączania NH4+ do aminokwasu uczestniczą 3 enzymy. Głównym enzymem jest dehydrogenaza glutaminowa, 2 pozostałe zabezpieczają syntezę glutaminową przy niskim stężeniu NH4+. Procesy biosyntezy aminokwasów (kw glutaminowy. Lizyna) prowadzone są w bioreaktorach o pojemności od 0-500 m3. Hodowla okresowa z zasilaniem pożywką. Fermentor musi być tak zbudowany Aby można było wprowadzać kilka rzeczy w czasie fermentacji. Reguluje się pH i temp. Pożywka zasilająca zazwyczaj zawiera źródło C i N. Źródło węgla: - melasa- buraczana (produkt odpadowy przemysłu cukrowniczego zawierający 50 -55% sacharozy) -z trzciny cukrowej (zawierająca 38 % sacharozy 20% cukrów redukujących) - hydrolizaty skrobiowe- zawierające ok. 60% glukozy - krystaliczna glukoza ( w tym przypadku zmniejsza się ilość ścieków) Do produkcji kwasu glutaminowego wykorzystywane są niewęglowodanowe źródła C - kwas octowy - n- alkany - alkohole (metanol, etanol) Źródło azotu - źr N amonowego w biosyntezie kwasu glut są amoniak gazowy lub w roztworze wodnym argonu i nieorganiczne sole amonowe (chlorek, siarczan, octan, fosforan) oraz mocznik. Jony amonowe są źródłem N, regulują pH środowiska. Organiczne źródła N dostarczają aminokwasów. Czynniki wzrostu aminokwasy i witaminy Aminokwasy wprowadzane są do podłoży z ekstraktem mięsnym, hydrolizatem kazeiny lub danego enzymu mimo obecności łatwo przyswajalnego źródła węgla- np. glukoza. Obecność tak łatwo przyswajalnego źródła C sprzyja wzrostowi biomasy a nie produkcji. Selekcja tego typu mutantów prowadzi się zwykle w warunkach chemostatu stosując podłoża zawierające dwie ilości glukozy. Doświadczenia wykazują że korzystniej jest jednak stosować w podłożu selekcyjnym nie glukozę a jej analog 2-deoksyglukozę. Cukier ten nie jest metabolizowany używa się w stosunkowo niskim stężeniu a enzymy rozpoznają go (przyłączają do centrum aktywnego) jako glukozę. Ta forma skriningu jest wykonywana bardzo powszechnie w odniesieniu do wielu szczepów grzybów i bakterii. 5) selekcja mutantów opornych na toksyczne analogii metabolitów pośrednich Technika selekcji mutantów opornych w stosunku do metabolitów pośrednich ma na celu wykrycie mutantów regulatorowych u których został zakłócony lun wyeliminowany system kontroli metabolicznej na zasadzie sprzężenia zwrotnego. Chodzi o wyizolowanie szczepów nie rozpoznających konkretnych inhibitorów przemian i wykazujących stałą derepresję syntezy enzymów danego szlaku. Cel ten można osiągnąć dodając do podłoża selekcyjnego analogi wybranych pośredników przemian metabolicznych. Najczęściej stosuje się analogi aminokwasów lub nukleotydów. Zniesienie systemu regulacji może powodować podwyższenie ilości lub katalitycznej aktywności odpowiednich enzymów. W literaturze podawane są liczne przykłady uzyskania tą droga mutantów regulatorowych wydzielających zwiększone ilości aminokwasów (arginina) kwasów organicznych i nukleotydów. Technika ta jest stosowana w poszukiwaniach mutantów produkujących zwiększone ilości metabolitów peryferyjnych i największe osiągnięcia uzyskano dla mutantów gromadzących kandycydynę a skrining był prowadzony w obecności analogu tryptofanu. Zwiększenie produkcji cefalosporyny dzięki skriningowi w obecności analogu metioniny. 6) selekcja mutantów o właściwościach detoksykacyjnych Celem tej formy skriningu jest izolowanie mutantów wykazujących podwyższoną zdolność do neutralizacji związków toksycznych dla wzrostu. Mechanizmy nabywania podwyższonej aktywności detoksykacyjnej i powiązanie tej cechy z określona produktywnością SA różne dla różnych szczepów i zależą od typu biosyntezy. Skrining polega na wprowadzeniu do pożywki selekcyjnej określonej substancji toksycznej w stężeniu najmniejszym hamującym wzrost i w tych warunkach izoluje się klony które wyrosły mimo obecności tych substancji toksycznych. Rozsiewy tego typu powtarza się wielokrotnie stosując coraz wyższe stężenia substancji toksycznych. Ta forma skriningu przyniosła bardzo dobre efekty dla szczepów produkujących antybiotyki β-laktamowe a substancjami toksycznymi dla wzrostu szczepów były: hydroksyloamina, imidazol i wybrane jony metali ciężkich. Z zastosowaniem tej techniki wyizolowano szczepy rodzaju Bacillus produkujących zwiększone ilości α-amylazy a substancjami toksycznymi były antybiotyki, ampicylina, streptomycyna, cykloseryna i tunikamycyna. Przyczyny zwiększenia wydajności wzrostu i tworzenia produktu mogą być różnorakie w przypadku zwiększenia oporności na antybiotyki może być to związane ze zmianami przepuszczalności ściany komrkowej a tym samym zwiększeniem możliwości wydzielenia produktu poza komórkę. 7) selekcja w kierunku obniżenia wrażliwości szczepów w stosunku do wybranych składników pożywek lub prekursorów. a) przykładem celowości tej formy skriningu jest biosynteza antybiotyków przez szczepy Streptomyces. Gromadzenie produktów przez szczepy tego rodzaju uwarunkowane jest występowaniem jonów fosforanowych w bardzo niskich stężeniach w związku z tym próbuje się wyselekcjonować mutanty o niższej wrażliwości na obecność tych jonów. Do selekcji stosuje się najczęściej technikę chemostatu a zamiast fosforanów do pożywki selekcyjnej wprowadza się ich analogi np. arseniany czy wanadany. Badania tego typu przynoszą dobr efekty jednakże w dalszym ciągu tolerancję szczepów Streptomyces na fosforany ocenia się jako niewystarczającą. b) innym przykładem tej formy selekcji może być poszukiwanie mutantów szczepów Penicilium o podwyższonej tolerancji na kwas fenylooctowy który jest prekursorem syntezy Penicyliny G. c) w procesach biosyntezy które najczęściej prowadzone są w warunkach tlenowych z ekonomicznego punktu widzenia ważną jest możliwość ograniczenia poziomu natlenienia. Tlen stanowi zwykle najdroższą pożywkę i ze względu na niską rozpuszczalność w wodzie musi być w sposób ciągły doprowadzany do podłoża wiąże się to z dużymi nakładami energetycznymi na wpompowywanie, rozdrabianie- rozpraszanie i filtrowanie powietrza oraz mieszanie. Tak więc obniżenie zapotrzebowania na tlen danego szczepu choćby o 10% może przynieść duże oszczędności. Przykładem prowadzenia tej formy skriningu może być uzyskiwanie określonej ilości lizyny przy o połowę mniejszym napowietrzeniu. 8) selekcja mutantów o korzystnej morfologii Łatwość operacji technologicznych uwarunkowane jest w dużym stopniu morfologią mikroorganizmów. Zagadnienie dotyczy głównie grzybów strzępkowych hodowanych w warunkach hodowli wgłębnej. Najczęściej preferowaną formą morfologiczną są kuleczki (pellets) o średnicy do 2 mm. Nie wskazany jest wzrost w postaci luźnej pulpy bądź kuleczek o średnicy powyżej 3 mm. Grzybnia rosnąca w formie luźnych strzępek powoduje że zawiesina hodowlana wykazuje właściwości nienewtonowskie i wysoką lepkość pozorną. Zmienienie się wartości lepkości w zależności od szybkości ścinania (szybkość mieszadła) oznacza wystepowanie stref o bardzo wysokiej lepkości w pobliżu ścian fermentora i względnie niskiej lepkości w pobliżu łopatek mieszadła. W tej sytuacji obserwuje się duże różnice w szybkości wnikania tlenu w zależności od miejsca w bioreaktorze. Ograniczone możliwości mieszania sprzyjają koagulacji pęcherzyków gazu a tym samym kontakt grzybni z tlenem jest znacznie ograniczony. Badania z tego zakresu prowadzone są w wielu laboratoriach i dotyczą one głównie szczepów Penicillium i

białka sojowego, wyciągiem narokowym kukurydzy. Wpływ stężenia biotyny na syntezę kwasu glutaminowego Wszystkie bakterie glutamino twórcze wymagają do wzrostu biotyny, a te rosnące w obecności węglowodorów jako źródła C, tiaminy. Stężenie biotyny uznawane jest za parametr krytyczny procesów biosyntezy kwasu glutaminowego Melasa z trzciny cukrowej zawiera od 1- 18 mg/kg biotyny a melasa buraczana od 0,04 do 0,13 mg/kg biotyny. Są to stężenia wielokrotnie wyższe d dawki biotyny optymalnej dla syntezy kwasu glutaminowego (2,5 mg/l). negatywny wpływ nadmiernych ilości biotyny na syntezę glutaminianu eliminuj się dodając do podłoża antybiotyk (penicylina) lub detergent (typu tween- pochodne wyższych kwasów tłuszczowych). Antybiotyk i detergent dodaje się na początku hodowli. Jeśli będzie za dużo biotyny warstwa fosfolipidowa będzie bardzo duża. Penicylin ai detergent blokują syntezę kwasów tłuszczowych. Penicylina uniemożliwia wytworzenie wiązań. Ścianka komórkowa jest przystosowana do dużej ilości biotyny do syntezy kwasu glut. Sole nieorganiczne : makro i mikro elementy - makroelementy: fosforan potasu i jony magnezu - mikroelementy: dwuwartościowe jony Mn i Fe Odczyn środ - pH 7,2-7,5- regulowane jonami amonowymi Natlenienie - wypadkowa ilośc3i wprowadzanego powietrza do pożywki i szybkości obrotów mieszadeł - napowietrzenie- z objętości powietrza na jedną objętość pożywki n jedną minutę RPM rzędu 500-550 obr na min, przy nadmiarze tlenu powstają produkty uboczne Temperatura 30-32^oC Produkcja kwasu glutaminowego - namnożenie biomasy - fermentacja (do 35 h) Wydajność przekracza 100 g/l Otrzymywanie glutaminianu sodu Kryształy kw glut o czystości 88% poddawane są działaniu NaOH (45-50% r-r), pH roztworu 6,8, filtracja, zatężanie zawiesiny s.m. 60%, krystalizacji, wirowanie kryształów, suszenie w strumieniu gorącego powietrza. Aspergillus. Udowodniono że zdolność mikroorganizmów do wzrostu w danej formie morfologicznej zależy od genotypu oraz od warunków hodowli. Parametrami które mają duży wpływ na zdolność tworzenia kuleczek są źródło azotu, pH i kompozycja makro i mikroelementów. Zagadnienie odpowiedniej morfologii jest również istotne dla technologii prowadzonych z udziałem drożdży. Konkretnie chodzi o ich zdolność do koagulacji i osadzania się. Ta morfologia determinuje np. produkcję piwa dolnej i górnej fermentacji. Szybko osadzające się drożdże gorzelnicze wykorzystywane są do produkcji etanolu w warunkach zwiększonego stężenia biomasy. 9) skrining w kierunku zwiększenia przepuszczalności osłon komórkowych. Jak wynika z danych literaturowych niekiedy czynnikiem ograniczającym wydzielanie produktu jest jego transport przez błonę cytoplazmatyczną lub ścianę komórkową. Spowodowanie mutacji obejmujących zmiany struktury błon komórkowych nie gwarantuje wprawdzie wzrostu i szybkości wydzielania metabolitów. Zwiększa jednak prawdopodobieństwo wystąpienia tego zjawiska. Udowodniono że na przepuszczalność ściany komórkowej duży wpływ ma obecność biotyny i zjawisko to jest wykorzystywane przy produkcji kwasu glutaminowego przez szczepy Corynebacterium. Poziom przepuszczalności osłon komórkowych powstaje w ścisłej korelacji z opornością komórek na związki toksyczne. I tak prowadząc skrining populacji w obecności różnego typu antybiotyków dochodzi do zmian w strukturze ścian komórkowej. W tym aspekcie szczególną uwagę zwraca się na izolowanie mutantów hodowanych w obecności penicyliny bądź antybiotyków polienowych. Wnioski z metod racjonalnego skriningu: 1) w wielu rodzajach selekcji wskazane jest prowadzenie hodowli w warunkach chemostatu. Pozwala ono na zwiększenie udziału monokultur wykazujących daną cechę pozytywną w stosunkowo krótkim czasie i przy niskiej pracochłonności. 2) dla technologii dla których znany w dużym stopniu jest mechanizm syntezy wskazane jest prowadzenie skriningu w obecności analogów substratów, produktu końcowego lub produktów pośrednich 3) w wielu przypadkach korzystnym okazuje się przeprowadzenie skriningu w obecności antybiotyku w stężeniu najmniejszym hamującym wzrost 4) zarówno dla biosyntezy metabolitów centralnych jak i peryferyjnych korzystnym może być poszukiwanie mutantów auksotroficznych i ich rewertantów. Mogą to być szczepy które wykształciły sobie poboczne drogi metaboliczne podlegające innym mechanizmom regulacyjnym co może spowodować intensyfikację syntezy określonego produktu. Synteza L- lizyny przez Coryne bacterium. Coryne bacterium glutaminian - tylko mutanty produkują L-lizynę ( w odróżnieniu do biosyntezy kw. Glutaminowego). Coryne bacterium glutaminian syntetyzują lizynę a także tyroninę, metioninę i izoleucynę z kw. L- asparaginowego. Pierwszym wspólnym enzymem syntezy tych aminokw.jest kinaza kw.asparaginowego. Aktywność tego enzymu jest allosterycznie hamowana przez 2 efektory: L-lizynę i L-treoninę. Warunkiem uruchomienia mechanizmu kontrolnego kinazy asparaginianowej jest równoczesna obecność lizyny i treoniny w nadmiarze. Aminokw. te pojedyńczo nie wpływają na akywność enzymu. Gen kinazy asparaginianowej LYSC składa się z 2 podjednostek: LYS-C alfa, LYS-C beta. Jeden promotor prowadzi transkrypcję LYS-C alfa i ASD ( genu kodującego dehydrogenazę semialdehydu kw. asparaginowego), zaś drugi zlokalizowany w obrębie LYS-C alfa - prowadzi transkrypcję LYS-C beta i ASD. System regulacji kinazy asparaginianowej znajduję się w podjednostce beta. Stwierdzono, że tylko mutacje w kodującym regionie tej podjednostki prowadzą do oporności kinazy asparaginianowej, zahamowanie przez nadmiar lizyny z L-treoniną. Negatywny wpływ tych aminokw. na działanie kinazy a tym samym na syntezę lizyny można także ograniczyć obniżając aktywność dehydrogenazy homoserynowej. Rezultatem tego jest niskie stężenie L-treoniny, który nie może mieć wpływu na aktywność kinazy. Kolejnym pkt kontroli szlaku syntezy lizyny jest pkt rozgałęzienia w miejscu semialdehydu kw. asparaginowego. Aldehyd ten może podlegać reakcjom przemian enzymat. przy współudziale dehydrogenazy homoser. bądź razem z pirogronianem ulegać przekształceniu do L-lizyny pod wpływem syntazy dihydrodipikolinianowej. Syntaza dihydrodipiko....nie podlega żadnej kontroli, dehydrogenaza homoserynowa jest kontrolowana na etapie swojej syntezy, a na poziomie aktywności przez treoninę. Trzeci etap kontroli biosyntezy lizyny zachodzi na poziomie transportu tego aminokw.z komórek do podłoża. Jest transportem aktywnym. Uwarunkowania CBG do nadprodukcji lizyny. (patrz kw.gtutaminowy). Reakcje anaplerotyczne spośród których najważn.są r-cje katalizowane przez karboksylazę pirogronianową i karboksykinazę fosfoenolopirogronianową. Dostarczają dużych ilości kwasu asparag. potrzebnego do syntezy lizyny. Bakterie CG posiadają prosty elastyczny system kontroli syntezy lizyny. Nie posiadają izoenzymów i związanych z tym dodatkowych mechanizmów regulacji. Izoenzymy- enzymy przekształacające ten sam substrat w taki sam produkt, ale różniące się sposobem regulacji ich aktywności. Nie wykazują one aktywności enzymów degradujących lizynę. Szczepy produkcyjne- mutanty. Mutanty auksotroficzne wymagające do wzrostu homoseryny lub treoniny i metioniny. Mutanty regulatorowe selekcjonowane spośród szczepów opornych na analog lizyny. Mutanty te pozbawione są systemu regulacji kinazy asparaginianowej. Technologia produkcji L-lizyny Róznice w składzie podłoża fermentacyjnego do prod lizyny i kw.glutam. :

- podłoże do prod lizyny musi zawierać od 30-60 μg/l biotyny, podczas gdy podłoże do prod kw.glutaminowego zawiera tej witaminy 10-20razy mniej, - podłoże do prod lizyny musi zawierac aminokw.niezbędne do wzrostu szczepu (aminokw auksotroficzne). Dominującą metodą prod lizyny jest fermentacja okresowa z zasilaniem (okresowym lub ciągłym). Pożywka zasilająca oprócz cukru zawiera zazwyczaj siarczan amonu, który pełni rolę nieorganicznego źródła azotu a dodatkowo neutralizuje tworzący się aminokwas. Lizyna w tym przypadku wyst w podłozu w postaci siarczanu. Jest dozowana po wyczerpaniu się cukru wprowadzonego do podłoża na początku hodowli. Hodowla okresowa z zasilaniem wymaga ścisłej kontroli dozowania pożywki. Umożliwia to uniknięcie nadmiernych strat składu pozywki w podłożu hodowlanym powodujących hamowanie procesu biosyntezy lizyny i syntezę produktów ubocznych (mleczan , octan, pirogronian ) a także skrócenie lag-fazy i ograniczenie wzrostu komórek. Przemysłowe szczepy Corynebacterium G mogą syntetyzować od 0,4 do 0,55 moli lizyny (m.cz.lizyny ok. 146 gramów) z 1 mola glukozy (m.cz.glukozy ok. 180 g.). Iich produktywność kształtuje się na poziomie od 4 do 8,5 mola lizyny * m-3 * godz -1. wydajnośc amonokw w procesach okresowych z ciagłym zasilaniem pożywką przekracza zazwyczaj 100g/l. Może dochodzić do 150 a nawet 170g/l. Fermentacja oddzielenie biomasy (biomasa) zatężanie krystalizacja suszenie L-lys-HCl Fermentacja koncentracja (woda) granulacja Biolys 60 Przemysłowa produkcja L-lizyny: 1 i 2 ) schematy otrzymywania krystalicznych (1) i paszowych (2) praparatów aminokwasu. Lizynę nagromadzoną w podłożu produkcyjnym wyodrębnia się różnymi metodami.pierwszy sposób polega na oddzieleniu części stałych z podłoża , izolowaniu lizyny metodą chromatografii jonowymiennej, zatężaniu i krystalizacji. Uzyskany tą metodą krystaliczny preparat zawiera 98,5 % L-lizyny*HCl (monochlorowodorek L-liz). Drugi sposób obejmuje oddzielenie biomasy i zatężenie klarownego płynu pohodowlanego a w jego wyniku powstaje alkaliczny koncentrat zawierający 50% L-liz. Trzeca procedura jest najbardziej efektywna, ponieważ pozwala zminimalizować straty aminokwasu oraz ilość ścieków. Wykorzystuje ona bezpośrednie suszenie natryskowe całego podłoża pofermentacyjnego, po którym następuje granulacja. Otrzymany granulat zawiera ok. 50% siarczanu L-lizyny.

---