Ćwiczenia 7

Budowa i właściwości peptydów i białek

Białka zbudowane z podstawowych 20 aminokwasów. Każdy z nich (oprócz glicyny) zawiera asymetryczny węgiel  z różnymi podstawnikami. Wszystkie należą do szeregu L(aminokwasy szeregu D znajdują się w mureinie bakterii oraz w mózgu, w układzie trawiennym ssaków zjaduje sie enzym do rozkładu D-aminokwasów), ale nie wiadomo, czemu ten stereoizomer został wybrane w toku ewolucji. Skoro wszystkie aminokwasy składają się z grup -COOH i -NH₂ przyłączonych do węgla asymetrycznego, jedynie grupa boczna decyduje o ich właściwościach.

Ważne właściwości grupy bocznej = polarność (hydrofobowość, hydrofilowość)

Wszystkie aminokwasy są w ogóle polarne (-COOH i -NH₂), ale istotne tu są właściwości grupy bocznej.

• HYDROFILOWE

• niedysocjujące ( -OH: Ser, Tyr, Thr;

-SH: Cys

- amidowa: Asn, Gln)

• dysocjujące ( - kwasy: Asp, Glu

- kwasowa lekko: Cys

- zasady: His, Lys, Arg)

• HYDROFOBOWE

• węglowodory ( - alifatyczne Ala, Val, Leu, Ile, Pro

- aromatyczne Phe, Trp)

• siarka symetr. ( - Met).

• Glicyna- brak grupy bocznej; nie jest hydrofobowa, często uznawana jako arbitralna a polarność innych ustala się względem niej)

Jak wykrywać białka?

• wykrywanie aminokwasów

• reakcja z ninhydryną

• wykrywanie wiązania peptydowego

• widmo absorpcji - maksimum przy 230 nm

• reakcja biuretowa - Cu²⁺ tylko ze związanymi aminokwasami

• wykrywanie mieszaniny pierścieni aromatycznych

• widmo absorpcji - maksimum przy 280 nm- dla mieszaniny aminokwasów aromatycznych(uśredniona, wypadkowa wartość)

• reakcja nitrowania = ksantoproteinowa - żółte zabarwienie

• wykrywanie metioniny

• reakcja -SH z Ag lub Hg - czarne strąty

• selektywne wytrącanie- jako związki wielkocząsteczkowe

Ile w rzeczywistości jest białek?

Z mieszaniny białek wychodzi ponad 100 aminokwasów!

• modyfikacje posttranslacyjne:

• fosforylacja- przyłączana jest grupa fosfonowa; ulegają jej prawie wszystkie białka; często silnie zmienia właściwości białka

• hydroksylacja

• metylacja

• acylacja- przyłączanie łańcuchów C16 lub C18 reszt kwasów tłuszczowych, nadające białku hydrofobowość(kotwica błonowa)

• izoprenylacja- również służy do dołączania reszt kotwiczących je w błonie

• glikozylacja- skomplikowane przyłączanie cukrów; dotyczy głównie białek powierzchniowych, zmienia funckję

Zmiany te powodują zwiększoną różnorodność kształtów grup bocznych aminokwasów, ich polarności, zdolności przyłączania innych podjednostek, substratów itp. Zawsze stały pozostaje rdzeń białkowy złożony z powiązanych H₂N-C-COOH.

Klasyfikacja peptydów

• peptydem nazywamy związek zbudowany z co najmniej 2 aminokwasów

• OLIGOPEPTYD = 10 - 20 reszt aminokwasowych

• POLIPEPTYD = 20 - 100

• BIAŁKO = 100 <

Wiązanie peptydowe

• bardzo mocne

• podlega hydrolizie:

• kwaśnej (niszczy Asx, Glx [w zasadzie przekształca Asn i Gln w Asp i Glu]) - stężony kwas HCl, 100°C, 24 h- warunki drastyczne

• zasadowej (wiele grup bocznych zniszczonych, Trp np.)- warunki jeszcze bardziej drastyczne warunki

• struktura = regularnie powtarzający się schemat szkieletu( na potrzeby II roku jest nierozgałęziony) + specyficzne łańcuchy boczne R₁, R₂, R₃... (ich sekwencja i proporcje w pełni determinuje właściwości peptydu)

• łańcuch ma zwrot, przyjęło się zapisywanie N → C (zgodne z kierunkiem translacji)

• wiązanie peptydowe to struktura płaska stabilizowana przez rezonans (układ trans 1000 razy częstszy)

• istnieje znaczna swoboda rotacji wokół wiązań łączących atom węgla  z atomem azotu łańcucha głównego i atomem węgla grupy karbonylowej (do opisania wystarcza jedynie kąt 

• Peptydy są zwykle całkowicie trans

Poniżej przedstawiono trzy dozwolone konformacje tripeptydu:

Funkcje białek

Praktycznie wszystkie mogą być przez nie pełnione ze względu na rozmaite kształty (kształt determinuje funkcję = np. dopasowanie przeciwciało-antygen, enzym-substrat):

• budulcowa

• transportowa

• regulacyjna

• sygnalizacyjna

• 
  katalityczna

• reperacyjna

• obronna

• zapasowa

• ruch

Wielorzędowa struktura białek:

W wyniku fałdowania łańcucha polipeptydowego powstaje specyficzna konformacja (kształt) białka. Wyróżnia się cztery poziomy struktury przestrzennej białek:

• I rzędowa

• Sekwencja aminokwasowa, determinuje właściwości fizykochemiczne białka a także kolejne poziomy jego struktury, determinowana genetycznie; determinuje właściwości fizykochemiczne białka a także kolejne poziomy jego struktury.

• II rzędowa

• Przestrzenne ułożenie (fragmentów łańcucha=struktura lokalna) reszt aminokwasowych znajdujących się blisko siebie w łańcuchu polipeptydowym;

• Do najczęściej występujących struktur drugorzędowych należą  helisa, struktura  i zwrot  (stabilnych w warunkach fizjologicznych jest niewiele; regularne, powtarzalne)

• -heliks = linia śrubowa, korkociąg, struktura płaska(jak sprężyna np. rozciągnięciu)

• prawoskrętnie skręcony (jak zwykłe śrubki) łańcuch główny polipeptydu

• łańcuchy boczne wystają na zewnątrz w ułożeniu helikanym

• stabilizowana wiązaniami wodorowymi między grupami NH i CO głównego łańcucha, grupa CO każdego aminokwasu wiąże się wiązaniem wodorowym z grupą NH aminokwasu, zajmującego w sekwencji liniowej pozycję wysuniętą do przodu o cztery reszty aminokwasowe

• każda reszta aminokwasowa jest przesunięta w stosunku do sąsiedniej o 0,15 nm wzdłuż osi helisy i obrócona o kąt 100° wokół osi, na jeden obrót helisy przypada więc 3,6 reszt aminokwasowych

• co 4 reszty aminokwasowe, w sekwencji liniowej oddzielone 3 innymi resztami, w helisie  znajdują się przestrzennie blisko siebie, tak, że idealnie tworzy się między nimi kierunkowe wiązanie wodorowe

• strukturę  helisy przyjmuje 30-35% białek; są jednak białka prawie wyłącznie o tej strukturze (miozyna, kolagen, α-keratyna) i takie, w których nie ma jej prawie wcale (chymotrypsyna)

• -kartka (harmonijka) = struktura dywanowa, plisowana kartka

• prawie całkowicie rozciągnięty łańcuch polipeptydowy, lekko zygzakowaty(kąty wiązań <180°)

• odległość reszt aminokwasowych 0,35 nm

•  wstążka (pojedynczy łańcuch) nie jest stabilizowany sama przez siebie, potrzebne co najmniej 2 nici równoległe (antyrównoległe częstsze = bardziej stabilne ale równoległe też), nie ma górnego ograniczenia liczby wstążek (zwykle 2 do 5)

• stabilizowana wiązaniami wodorowymi pomiędzy grupami CO i NH odrębnych łańcuchów polipeptydowych

• łańcuchy boczne aminokwasów są poza strukturą (wystają w „górkach: i :dolinkach”)

• strukturę  kartki przyjmuje 25% białek; przykładem białka zbudowanego z antyrównoległych  wstążek jest fibroina(białko jedwabiu)

• III rzędowa
  

• Przestrzenne ułożenie całego łańcucha polipeptydowego, ułożenie względem siebie poszczególnych struktur drugorzędowych

• zakręty , zwroty  (struktura spinki do włosów)

• tworzą się dzięki wiązaniom wodorowym, powstającym w łańcuchu polipeptydowym między grupą -CO- reszty n i grupą -NH- reszty n+3

• powoduje to natychmiastowe odwrócenie łańcucha polipeptydowego

• często łączą antyrównoległe nici 

• stanowią około 20% struktur II rzędowych białek

• pozostałe 20% to:

• struktury rzadkie

• nieregularne

• nieokreślone (brak jakiejkolwiek struktury II rzędowej)

• IV rzędowa

• Dotyczy białek zbudowanych z więcej niż jednego łańcucha polipeptydowego (białka podjednostkowe) i oznacza ułożenie względem siebie podjednostek polipeptydowych i rodzaj oddziaływań między nimi

• przeciętne białko- kilkaset(200-700) reszt aminokwasowych

Generalna tendencja fałdowania białek:

• w środowisku hydrofilowym = dążenie do ukrycia reszt hydrofobowych wewnątrz cząsteczki, eksponowanie reszt polarnych na powierzchni

• w środowisku hydrofobowym (np. błona komórkowa) = tendencja odwrotna

Typowe kształty białek:

• globularne - najczęstsze; przybliżone kule- częsci hydrofobowe chowają się do środka (jak mioglobina na wcześniejszej stronie) - typowe białko jest właśnie globularne, ma każdej ze struktur II rzędowych po trochu

• fibrylarne - białka wydłużone, kurczące się (keratyna poniżej)

Białka złożone

Mają dodatkowe składniki- KOFAKTORY(wchodzi w skłąd białka nie będąc łańcuchem peptydowym):

• jony metali (hemoglobina)

• koenzymy

• grupy prostetyczne

Przyjmowanie struktury przez białko

Odpowiedzialne siły:

• oddziaływania van der Waalsa (wymuszony dipol)- stabilizują części hydrofobowe

• tzw. Oddziaływania hydrofobowe

• wiązania wodorowe

• elektrostatyczne (silne i słabe)

• mostki dwusiarczkowe (stabilizują zwykle, a nie tworzą; obecne raczej w białkach pozakomórkowych, gdyż wewnątrz komórki panuje potencjał redukujący, ponieważ w utleniającym życie nie jest możliwe).

Rozdzielanie białek

Metodę dobieramy do konkretnego materiału rozdzielanego. Możliwości chromatografii przedstawia tabela:

Cecha białka	Technika chromatograficzna
wielkość i/lub kształt	filtracja żelowa (sączenie molekularne) chromatografia podziałowa
ładunek	chromatografia jonowymienna
hydrofobowość	chromatografia hydrofobowa
specyficzność biologiczna	chromatografia powinowactwa

1. 
   Dializa

• 
  
  
  pozwala na usunięcie z roztworu związków drobnocząsteczkowych (cukry proste, aminokwasy, nukleotydy oraz sole)

• 
  polega ona na przechodzeniu przez półprzepuszczalną błonę (np. celulozową błonę woreczka dializacyjnego) cząstek mniejszych niż pory w błonie, a zatrzymywaniu cząstek zbyt dużych, aby mogły przejśc przez pory (np. białka lub kwasy nukleinowe)

• w środowisku wodnym następuje wyrównanie stężeń związków drobnocząsteczkowych po obu stronach błony

• związki wielkocząsteczkowe nie mogą przechodzić przez pory, ale układ będzie dążył do wyrównania stężeń, zatem woda będzie wnikała do woreczka, aby zmniejszyć w nim stężenie np. białek

• aby dializa zaszła z dużą wydajnością należy kilkakrotnie zmieniać rozwór, wobec którego dializujemy (jest to bardziej wydajne, niż zwiększanie objętości roztworu); w pierwszym przypadku oczyszczenie rośnie wykładniczo, a w drugim liniowo przy zastosowaniu tej samej objętości roztworu

• wada: zjawisko 0-1 (albo przechodzi, albo nie) - ogólna informacja, średnica jest większa od porów błony albo nie

• dobra do celów preparatywnych

• nie zawsze prowadzi się dializę wobec wody, może to być np. roztwór soli fizjologicznej

2. Filtracja żelowa (sączenie molekularne)

• wykorzystywane złoże zawierające obojętną chemicznie hydrofilową matriks o ściśle określonym usieciowaniu, które tworzy ziarna (faza stacjonarna) o określonych wymiarach, przepłukiwana wodą/buforem/solą fizjologiczną (faza ruchoma)

• cząsteczki większe niż ziarna nie mogą do nich wniknąć i przemieszczają się w kolumnie szybciej niż małe, które zajmują przestrzeń wewnątrz i na zewnątrz ziaren (mają do przebycia większą objętość)

• jako pierwsze w wycieku pojawią się większe cząsteczki(nie dyfundują do złoża, porusza się po fazie ruchomej)

• w zależności od stopnia usieciowania złoża można rozdzielać białka o różnej wielkości

• stosowana do wyznaczania masy cząsteczkowej białka lub kompleksów wielobiałkowych, a także do usunięcia soli z preparatów izolowanego białka

• analityczna i preparatywna

• jest w stanie małe różnice w masie rozdzielić (istotne, żeby były to białka globularne, fibrylarne z mniej przewidywalnym prawdopodobieństwem wnikają do ziaren)

Objętość całkowita kolumny (obie fazy razem)

Objętość pusta kolumny (objętość fazy ruchomej)

Apoproteina+Kofaktor= białko złożone

Woda

Zw. wielkocząsteczkowy

Zw. drobnocząsteczkowy

Cząsteczka wody

Woreczek do dializy

3

---