MATERIAŁY POMOCNICZE I ĆWICZENIA LABORATORYJNE

Z TECHNOLOGII PREPARATÓW ENZYMATYCZNYCH POCHODZENIA MIKROBIOLOGICZNEGO

Praca zbiorowa pod redakcją

Józefa Synowieckiego

Wydawnictwo Politechniki Gdańskiej

Gdańsk 2007

3.3. Źródła i kryteria wyboru enzymów

3.3.1. Źródła enzymów

Reakcje katalizowane enzymami są od dawna wykorzystywane w serowarstwie, piekarstwie, piwowarstwie, soleniu ryb, dojrzewaniu mięsa i wytwarzaniu produktów fermentacji. Przebiegają one pod wpływem enzymów pochodzących z drobnoustrojów lub znajdujących się w przetwarzanym surowcu. Pierwszymi preparatami enzymatycznymi były podpuszczka uzyskiwana z trawieńców młodych cieląt oraz słód wytwarzany z kiełkujących ziaren zbóż. W dalszym etapie rozwoju technologii enzymatycznych wykorzystano ekstrakty tkanek roślin lub organów zwierząt. Preparaty te wykazywały niewielką aktywność katalityczną a ich zanieczyszczenie innymi enzymami prowadziło do wytwarzania niepożądanych produktów ubocznych. Rozwój chromatograficznych metod oczyszczania enzymów pozwolił na wyeliminowanie tych niedogodności ale ze względu na małą zazwyczaj zawartość enzymu w tkankach konieczny jest przerób dużej ilości nie zawsze łatwo dostępnego lub trudnego do zgromadzenia surowca. Jest to jedną z przyczyn dużego rozpowszechnienia biotechnologicznych metod produkcji enzymów polegających na wykorzystaniu odpowiednio wyselekcjonowanych drobnoustrojów. Niektóre enzymy roślinne i zwierzęce są jednak nadal wykorzystywane. Ich przykładem są enzymy proteolityczne uzyskiwane z ananasa lub niektórych innych roślin tropikalnych (bromelaina, ficyna, papaina), z trzustki wołowej (trypsyna, chymotrypsyna, elastaza) oraz z soku żołądkowego trzody chlewnej (pepsyna).

Drobnoustroje charakteryzują się dużą różnorodnością wytwarzanych enzymów, często niespotykanych w tkankach roślin i zwierząt, dostępnością surowca spowodowaną szybkim przyrostem biomasy oraz możliwością intensyfikacji syntezy biokatalizatora przez zmianę składu pożywki, optymalizację warunków hodowli lub ulepszenie szczepu. Ważną zaletą jest znaczne niekiedy zróżnicowanie optymalnych warunków działania analogicznych enzymów pochodzących z różnych mikroorganizmów, co stwarza możliwość wyboru biokatalizatora dostosowanego do warunków projektowanego procesu.

3.3.2. Ulepszanie szczepów drobnoustrojów

Do ulepszania szczepów stosuje się mutacje indukowane rozmaitymi czynnikami fizycznymi lub chemicznymi (ultrafiolet o długości fali około 260 nm, promieniowanie jonizujące kwas azotowy (III), hydroksylamina, bromouracyl, aminopuryna, akrydyny lub związki alkilujące), których działanie prowadzi do przypadkowych zmian cech mikroorganizmów. Podczas przeprowadzanej w dalszym etapie selekcji wyodrębniane są mutanty charakteryzujące się:

• dużą produkcyjnością;

• konstytutywnym, nie wymagającym stosowania induktorów wytwarzaniem enzymu;

• ograniczeniem syntezy innych niepożądanych enzymów lub trudnych do usunięcia metabolitów lub toksyn;

• małą wrażliwością na działanie represorów hamujących wytwarzanie pożądanego białka;

• wydzielaniem produkowanego enzymu do cieczy pohodowlanej;

• odpornością na niektóre antybiotyki zapobiegające zainfekowaniu hodowli niepożądanymi drobnoustrojami;

• korzystnymi właściwościami technologicznymi (mała zdolność pienienia hodowli, ułatwiona flokulacja komórek, ograniczone wytwarzanie śluzu);

• małymi wymaganiami pokarmowymi, umożliwiającymi hodowlę na nieskomplikowanych pożywkach.

Oczekiwanie na pojawienie się pożądanej mutacji jest często długotrwałe i lepsze efekty daje mutageneza ukierunkowana. Polega ona na wprowadzeniu do komórek za pośrednictwem odpowiedniego wektora (plazmidu lub faga) materiału genetycznego zmodyfikowanego w zaplanowany sposób lub pochodzącego z innego mikroorganizmu. Uzyskane w ten sposób rekombinowane drobnoustroje wytwarzają zmodyfikowane lub nowe dla komórki białka i są w związku z tym przydatne do ekspresji enzymów pochodzących z ekstremofili. Ekstremofile zasiedlające biotopy niedostępne dla rozwoju innych mikroorganizmów, np. z powodu zbyt wysokiej lub niskiej temperatury, znacznego zasolenia lub nieodpowiedniego pH środowiska wytwarzają enzymy działające w warunkach powodujących inaktywację biokatalizatorów innego pochodzenia. Przemysłowe wytwarzanie enzymów z tych drobnoustrojów jest jednak utrudnione niewielką wydajnością biomasy i koniecznością prowadzenia hodowli zazwyczaj w beztlenowych warunkach, specyficznymi wymaganiami pokarmowymi oraz częstym wydzielaniem toksycznych lub działających korozyjnie metabolitów (np. H₂S lub H₂SO₄). Rozwiązaniem problemu jest klonowanie genu kodującego syntezę ekstremofilnego enzymu do mikroorganizmu charakteryzującego się dużą wydajnością biomasy oraz możliwością hodowli w „łagodnych” warunkach, na nieskomplikowanych podłożach. Ważną zaletą rekombinowanych drobnoustrojów jest znaczna niekiedy nadekspresja enzymu, nawet do około 25 % ogólnej ilości białek komórkowych, jak też uproszczenie procedury oczyszczania biokatalizatora. Można to osiągnąć uzupełniając klonowany gen sekwencją nukleotydów kodującą syntezę wbudowywanych w cząsteczkę enzymu białkowych domen fuzyjnych o specyficznym powinowactwie do złoży chromatograficznych z immobilizowanym ligandem. Wprowadzanie domen fuzyjnych nie jest potrzebne w przypadku oczyszczania termostabilnych enzymów, które nie ulegają denaturacji w warunkach powodujących cieplne strącenie innych białek komórkowych, usuwanych następnie przez odwirowanie lub filtrację.

Enzymy wytwarzane dla przemysłu spożywczego, kosmetycznego lub farmaceutycznego pochodzą ze stosunkowo niewielkiej liczby szczepów bakterii, grzybów lub drożdży, których przykłady zamieszczono w tabeli 2. Jedną z przyczyn tych ograniczeń jest konieczność stosowania drobnoustrojów zaklasyfikowanych jako RAS (recognized as safe). Należą do nich niepatogenne, stabilne taksonomicznie mikroorganizmy, hodowane na podłożach pozbawionych toksycznych składników i substancji mutagennych dla drobnoustrojów. Uzyskanie statusu RAS jest konieczne w przypadku produkcji każdego nowego enzymu (a szczególnie rekombinowanego) nawet w przypadku gdy pochodzi on z mikroorganizmu ocenionego jako bezpieczny. Dokonując wyboru źródła enzymu należy ponad to uwzględnić produkcyjność szczepu, warunki jego hodowli i skład pożywki oraz szybkość przyrostu biomasy komórek. Dla zachowania pełnej produkcyjności wybranego mikroorganizmu przez dłuższy czas należy prowadzić hodowlę w warunkach zapobiegających degeneracji szczepu lub zahamowania jego rozwoju z powodu zainfekowania pożywki innymi drobnoustrojami.

Tabela 2. Niektóre drobnoustroje wykorzystywane do przemysłowej produkcji enzymów

Mikroorganizm	Wytwarzane enzymy
Bacillus licheniformis Bacillus coagulans Bacillus amyloliquefaciens Bacillus acidopullulyticus Bacillus stearothermophilus Bacillus subtilis Klebsiella planicola Streptomyces rubiginosus Streptoverticillium mobaraense	α-amylaza, subtylizyna A (alkaliczna endoproteaza serynowa) izomeraza ksylozowa (glukozowa) metaloendoproteaza pululanaza maltogenna amylaza maltogenna amylaza, hemicelulaza pululanaza izomeraza ksylozowa (glukozowa) transglutaminaza
Aspergillus niger Aspergillus oryzae Mucor miehei Rhizopus oryzae Candida rugosa	glukoamylaza, α-glukozydaza, celulaza, ksylanaza, pektynaza, lipaza, katalaza, oksydaza glukozowa, fitaza glukoamylaza, α-amylaza, β-galaktozydaza, celulaza, lipaza proteaza stosowana jako substytut chymozyny, esteraza-lipaza lipaza lipaza
Kluyveromyces lactis Saccharomyces cerevisiae	rekombinowana chymozyna, β-galaktozydaza β-fruktofuranozydaza

Ilość wytwarzanego enzymu jest często skorelowana z przyrostem biomasy komórek i pozostaje niezmieniona lub maleje po zakończeniu fazy wykładniczego wzrostu. W innych przypadkach synteza enzymu następuje dopiero w tzw. idiofazie kończącej etap intensywnego rozwoju hodowli. Przyczyną ograniczenia lub nawet zupełnego zahamowania produkcji niektórych biokatalizatorów może być wprowadzenie do pożywki glukozy lub innego łatwo metabolizowanego źródła węgla lub nagromadzenie się w podłożu produktów metabolizmu drobnoustrojów. Niektóre mikroorganizmy charakteryzują się zróżnicowaniem optymalnych warunków syntezy enzymu i rozwoju komórek. Przykładem tego jest Bacillus megaterium o optymalnej temperaturze rozwoju 42 °C i największej wydajności wytwarzania enzymów proteolitycznych uzyskiwanej w 28 °C. Hodowlę takich drobnoustrojów przeprowadza się dwuetapowo zmieniając temperaturę lub pH środowiska po zakończeniu okresu intensywnego przyrostu biomasy. Wydajność enzymów zewnątrzkomórkowych zależy też od szybkości ich sekrecji, którą można wielokrotnie zwiększyć dodając do pożywki czynniki permeabilizujące błonę komórkową, takie jak: niejonowe detergenty, sól sodowa siarczanu dodecylu (SDS) lub niektóre sole (K⁺, Na⁺, Li⁺).

3.3.3. Zalety i wady technologii enzymatycznych

Technologie enzymatyczne są korzystną alternatywą wielu stosowanych już procesów chemicznych, przebiegających bez lub z udziałem rozmaitych katalizatorów. Jednym z przykładów jest przeprowadzana w kwaśnym lub alkalicznym środowisku hydroliza polisacharydów, białek i innych biopolimerów. Jedną z zalet reakcji enzymatycznych są łagodne warunki ich przebiegu ograniczające wytwarzanie niepożądanych produktów ubocznych. Duże znaczenie ma też specyficzność działania wielu enzymów umożliwiająca wytworzenie produktów o ściśle określonym składzie chemicznym i konfiguracji przestrzennej. Jest to istotne np. w przemyśle farmaceutycznym, bo rozmaite stereoizomery związku wykazują często przeciwstawne oddziaływanie fizjologiczne (lecznicze i obojętne lub nawet szkodliwe). Przy wytwarzaniu żywności kwestionowane jest niekiedy stosowanie niektórych katalizatorów ze względu na możliwość zanieczyszczenia wyrobu ich pozostałością. Zagrożenie to nie istnieje w przypadku użycia enzymów, które podobnie jak i inne białka są naturalnym składnikiem produktów spożywczych. Enzymy charakteryzują się ponad to dużą aktywnością i szybkość reakcji enzymatycznych jest zazwyczaj znacznie większa niż w przypadku stosowania innych katalizatorów. Przykładem tego jest katalaza, której jedna cząsteczka rozkłada w ciągu sekundy około 80 tys. cząsteczek nadtlenku wodoru. Nie bez znaczenia jest też fakt, że technologie enzymatyczne nie wymagają używania agresywnych chemicznie substancji i są w związku z tym bardziej bezpieczne i przyjazne dla środowiska. Wadą technologii enzymatycznych jest możliwość inaktywacji biokatalizatora pod wpływem niektórych składników przetwarzanego surowca oraz występujące w przypadku długotrwałych reakcji zanieczyszczenie reaktora mikroorganizmami dobrze rozwijającymi się w łagodnych warunkach procesu. Stosowanie dość kosztownych często enzymów nie jest celowe w przypadku gdy tradycyjna technologia jest bezpieczna dla środowiska i zapewnia wytwarzanie produktu o dobrej jakości. Planując wykorzystanie i dokonując wyboru odpowiedniego enzymu należy więc określić:

• Jakie są pożądane zmiany właściwości przetwarzanego surowca (smak, zapach, barwa tekstura, wodochłonność, zdolność emulgowania i żelowania, zawartość składników o niepożądanym oddziaływaniu).

• Składnik surowca, który zamierzamy zmodyfikować.

• Możliwość uzyskania zamierzonego efektu bez udziału kosztownego enzymu.

• Rodzaj enzymu najlepszy do wytworzenia produktu o zaplanowanych właściwościach.

• Możliwość stosowania tańszych, mniej oczyszczonych preparatów enzymu.

• Podatność innych składników produktu na niepożądane zmiany pod wpływem zastosowanego enzymu.

• Czy zanieczyszczenia, a szczególnie inne enzymy znajdujące się w preparatach produkowanych dla potrzeb przemysłu nie spowodują pogorszenia jakości produktu.

• Sposób prowadzenia procesu (okresowy lub ciągły z zastosowaniem immobilizowanych enzymów).

• Sposób prowadzenia reakcji (w roztworze lub na granicy faz).

• Czy warunki procesu zapewniają stosowanie enzymu bez jego szybkiej inaktywacji.

• Jak inne, nie przetwarzane składniki surowca wpływają na aktywność enzymu.

• Jaka powinna być selektywność enzymu i warunki jego działania.

• Kwasowość przetwarzanego surowca i możliwość jej dostosowania do optymalnego pH reakcji enzymatycznej.

• Potrzebę i sposób inaktywacji enzymu w gotowym produkcie po zakończeniu procesu.

• Czy wybrany sposób inaktywacji i pozostałość enzymu nie spowodują pogorszenia jakości produktu.

• Jak ograniczyć hamowanie enzymu produktami reakcji.

3.4. Preparaty enzymatyczne stosowane w przemyśle i analityce

3.4.1. Rodzaje preparatów enzymatycznych

Wytwarzane dla przemysłu biokatalizatory są dostępne w formie substancji stałej lub roztworów o różnym stopniu zagęszczenia i oczyszczenia. Trzecim rodzajem preparatów stosowanych w niektórych procesach produkcyjnych są immobilizowane enzymy, których zalety i wady przedstawiono w rozdziale 6. Surowcem stosowanym do produkcji preparatów enzymatycznych jest ciecz pohodowlana z nagromadzonymi enzymami zewnątrzkomórkowymi albo ekstrakt biomasy wykorzystywany do wytwarzania enzymów wewnątrzkomórkowych. Ciekłe preparaty są zazwyczaj mało oczyszczone i oprócz substancji aktywnej (enzymu) zawierają także inne składniki. Stosuje się je do katalizowania procesów w których oddziaływanie zanieczyszczających preparat enzymów oraz pozostałych niezupełnie usuniętych składników surowca i dodanych substancji stabilizujących nie ma istotnego znaczenia. Poszczególne preparaty tego rodzaju różnią się dość znacznie aktywnością i kosztem, zależnym między innymi od stopnia oczyszczenia. Preparaty w formie stałej są produkowane przez suszenie rozpyłowe lub liofilizację oczyszczonej cieczy pohodowlanej lub ekstraktu biomasy komórek. Stosuje się także precypitację białek rozpuszczalnikami organicznymi lub przez wysalanie. Do oczyszczonego w pożądanym stopniu białka enzymatycznego dodaje się zazwyczaj rozmaite wypełniacze (skrobia, dekstryny, siarczan amonu, bentonit) pełniące jednocześnie funkcję stabilizatora zwiększającego trwałość preparatu. Produkowane dla przemysłu preparaty nigdy nie są homogennym białkiem enzymatycznym, bo tak znaczne oczyszczenie wielokrotnie zwiększa ich koszt. Usuwane są więc tylko te składniki, które przeszkadzają w przebiegu katalizowanego procesu lub inicjują wytwarzanie niepożądanych produktów ubocznych. Stosowanie znacznie oczyszczonych preparatów jest natomiast konieczne w analityce.

3.4.2. Przykłady zastosowań

Najszersze zastosowanie w przemyśle mają enzymy należące do klasy hydrolaz wykorzystywane między innymi do wytwarzania artykułów żywnościowych, utylizacji produktów ubocznych oraz w przemyśle celulozowo-papierniczym, tekstylnym, garbarstwie i produkcji środków piorących. Dość często używane są także niektóre izomerazy, oksydoreduktazy oraz transglutaminaza.

Preparaty enzymów amylolitycznych stosuje się do wytwarzania syropów skrobiowych, użytecznych jako składnik wyrobów cukierniczych i piekarskich, odżywek dla niemowląt, mleka w proszku, sosów, keczupów, zabielaczy do kawy, słodzików, dżemów oraz polioli. Wysokoscukrzone syropy służą także do otrzymywania karmelu, glukozy, syropów fruktozowych i są dodawane do brzeczki piwnej. Początkiem procesu wytwarzania syropów jest dodanie termostabilnej α-amylazy do zawiesiny ziaren skrobiowych, ogrzewanej następnie gorącą parą wodną (Rys.1). Podwyższenie temperatury do około 105 °C jest konieczne w celu degradacji i upłynnienia ziaren skrobi, co umożliwia ich enzymatyczną hydrolizę. Znacznemu wzrostowi lepkości zolu skrobiowego podczas upłynniania zapobiega szybkie rozszczepienie cząsteczek amylozy i amylopektyny na mniejsze fragmenty pod wpływem endoamylazy (α-amylazy) zachowującej aktywność w warunkach procesu. Produktami upłynniania są oligosacharydy zbudowane z 10-13 reszt glukozy oraz „dekstryny graniczne” wytwarzane z rozgałęzień cząsteczek amylopektyny zawierających nie rozszczepiane przez α-amylazy wiązania α-1,6-glikozydowe. Obecnie często stosowanym preparatem jest Termamyl®, zawierający jako substancję aktywną α-amylazę z Bacillus licheniformis, która zachowuje aktywność po kilku godzinach ogrzewania w 90 °C. Wytwarzane podczas upłynniania skrobi maltodekstryny są przydatne jako składnik ograniczający wysychanie wyrobów cukierniczych i zapobiegający wzrostowi kryształów lodu w mrożonej żywności oraz jako substytut lipidów w nisko kalorycznej żywności. Hydrolizat skrobiowy wytworzony z udziałem α-amylazy jest produktem pośrednim służącym do otrzymywania silnie scukrzonych syropów glukozowych oraz maltozowych. Stosuje się w tym celu glukoamylazę (EC 3.2.1.3) oraz β-amylazę (EC 3.2.1.2) odszczepiające glukozę albo maltozę od strony nieredukującego końca cząsteczek oligosacharydów. Optymalne warunki działania preparatów enzymatycznych stosowanych obecnie w etapach upłynniania i scukrzania skrobi są dość znacznie zróżnicowane. Niezbędne jest więc obniżenie pH i temperatury mieszaniny reakcyjnej przed dodaniem glukoamylazy lub β-amylazy (Rys.2). Maltogenna α-amylaza z Bacillus stearothermophilus (Novamyl) jest wykorzystywana w piekarstwie do intensyfikacji wytwarzania dekstryn ułatwiających formowanie pożądanej tekstury i zapachu skórki chleba oraz spowolnienia czerstwienia pieczywa wskutek ograniczającego retrogradację skrobi skrócenia odgałęzień cząsteczek amylopektyny.

Osiągnięcie dużej wydajności scukrzania jest między innymi utrudnione formowaniem dekstryn granicznych. Glukoamylaza działa wprawdzie na znajdujące się w nich wiązania α-1,6-glikozydowe ale szybkość reakcji jest niewielka. W przypadku β-amylazy nie wykazującej zupełnie aktywności względem wiązań α-1,6-glikozydowych tylko 50-60 % znajdującej się w skrobi amylopektyny jest przekształcane na maltozę. Ograniczenia wydajności można uniknąć stosując mieszaninę glukoamylazy lub β-amylazy z pululanazą likwidującą rozgałęzienia cząsteczek. Przyczyną zmniejszenia wydajności w przypadku stosowania glukoamylazy jest też wytwarzanie maltozy i izomaltozy jako skutek nasilenia reakcji odwrotnych po przekroczeniu 30-35 % stężenia glukozy w syropie. Hydrolizaty skrobiowe po oczyszczeniu węglem aktywnym i demineralizacji na żywicach jonowymiennych są stosowane do produkcji syropów fruktozowych używanych między innymi jako substytut sacharozy w żywności dla diabetyków. Do przekształcenia glukozy we fruktozę stosuje się immobilizowaną izomerazę ksylozową (glukozową) wykorzystując proces opisany w rozdziale 6.4.

Upłynnianie skrobi z udziałem α-amylazy i pululanazy jest też początkowym etapem wytwarzania cyklodekstryn. Uzyskane linowe oligosacharydy zachowują helikalną konformację charakterystyczną dla amylozy i fragmentów cząsteczek amylopektyny. Stosowana następnie glikozylotransferaza cyklomaltodekstryn (EC 2.4.1.19) uzyskana np. z Bacillus macerans lub Thermoanaerobacter sp. łączy zbliżone do siebie końce helisy wytwarzając mieszaninę pierścieniowych cząsteczek α-, β- lub γ-cyklodekstryn zbudowanych z sześciu, siedmiu albo ośmiu reszt glukozy. Udział poszczególnych rodzajów cyklodekstryn zależy od pochodzenia enzymu oraz od temperatury i kwasowości środowiska reakcji. Cyklodekstryny tworzą kompleksy inkluzyjne z substancjami hydrofobowymi o kompatybilnej strukturze i wielkości cząsteczek. Są więc często stosowane w przemyśle spożywczym, kosmetycznym i farmaceutycznym jako składniki stabilizujące, zapobiegające stratom łatwo lotnych substancji, maskujące niepożądany smak i zapach, ułatwiające rozpuszczenie hydrofobowych związków chemicznych w wodzie lub chroniące witaminy i barwniki przed utlenieniem. Produkcję cyklodekstryn utrudnia mała specyficzność stosowanych enzymów, które wytwarzają mieszaninę wymienionych związków i dla rozdzielenia poszczególnych składników konieczne jest ich strącanie w postaci kompleksu z niektórymi rozpuszczalnikami organicznymi. Do oddzielenia α-cyklodekstryn stosuje się np. 1-dekanol.

Duże znaczenie mają prowadzone od dłuższego czasu badania nad wykorzystaniem biomasy roślin jako odnawialnego źródła energii. Jednym z racjonalnych sposobów jej zagospodarowania jest wytwarzanie biopaliw zawierających etanol. Wykorzystanie celulozy jako źródła węgla dla rozwoju drożdży jest możliwe dopiero po hydrolizie polisacharydu. Enzymatyczną degradację celulozy utrudniają jednak jej właściwości oraz znajdujące się w biomasie hemicelulozy i lignina. Skutkiem nierozpuszczalności celulozy jest uzależnienie szybkości enzymatycznej hydrolizy od wielkości powierzchni włókien polisacharydu, dostępnej dla tworzenia kompleksu z enzymem. Konieczna jest więc wstępna obróbka surowca usuwająca barierę ligninową oraz zwiększająca porowatość i udział amorficznych obszarów włókien celulozowych. Można to np. osiągnąć przez ogrzanie materiału pod ciśnieniem do temperatury około 250 °C a następnie szybkie ekspandowanie wywołujące „odklejenie” ligniny oraz wzrost powierzchni włókien. Stosuje się także środki spęczniające, jak np. roztwory NaOH lub niektórych soli. Do hydrolizy celulozy stosowane są celulazy atakujące wiązania β-1,4-glikozydowe. Ze względu na specyficzność działania wyróżnia się wśród nich endo-β-1,4-glukanazy (EC 3.2.1.4) działające na wiązania wewnątrz cząsteczek polisacharydu oraz dwa rodzaje egzo-β-1,4 glukanaz różniących się oddzielaniem glukozy lub celobiozy od nieredukującego końca cząsteczki celulozy. Do kompleksu enzymów celulolitycznych należy także β-glukozydaza katalizująca hydrolizę celobiozy, której nagromadzenie się w środowisku reakcji jest niekorzystne z powodu znacznego ograniczenia aktywności endo-β-1,4-glukanazy. Produkowane obecnie preparaty celulaz pochodzą z Trichoderma reesei lub Aspergillus niger. Są one między innymi wykorzystywane w celu poprawy wydajności tłoczenia soków owocowych, intensyfikacji ekstrakcji białek roślinnych oraz w środkach piorących służących do regeneracji koloru i zmiękczania tkanin bawełnianych. Stosuje się je także do zwiększenia przyswajalności paszy dla zwierząt hodowlanych. Przeszkodą w rozwoju wykorzystania materiałów lignocelulozowych do produkcji etanolu jest mała wydajność ich scukrzania oraz duży koszt ksylanaz i enzymów celulolitycznych.

Ksylanazy są enzymami degradującymi szkielet cząsteczek ksylanu stanowiącego główny składnik hemiceluloz. Zawiera on reszty β-D-ksylopiranozy połączone wiązaniami β-1,4- a niekiedy β-1,3-glikozydowymi i ze względu na częściową rozpuszczalność w wodzie oraz dość niski stopień polimeryzacji jest podatny na hydrolizę enzymatyczną. Do hydrolaz ksylanu należą głównie endoksylanazy (EC 3.2.1.8) oraz egzoksylanazy (EC 3.2.1.37) nazywane też β-ksylozydazami. Zupełna degradacja cząsteczek ksylanu jest jednak niemożliwa bez stosowania odrębnych enzymów, usuwających znajdujące się w rozgałęzieniach polisacharydu reszty L-arabinozy kwasu glukuronowego i innych cukrów. Dostępne w handlu preparaty ksylanaz (np. Pentopan 500, Fungamyl SHX lub Fermizyme H400E) są otrzymywane metodą biosyntezy mikrobiologicznej z wykorzystaniem Humicola insulens lub Aspergillus niger. Stosuje się je w piekarstwie do poprawy właściwości reologicznych ciasta oraz do ulepszenia tekstury, walorów smakowych, barwy i trwałości chleba. Ksylanazy są także wykorzystywane do modyfikacji składników paszy dla zwierząt i usuwania gorzkości soku z owoców cytrusowych.

Duże znaczenie mają biokatalizatory służące do otrzymywania pozbawionych laktozy produktów mlecznych, syropów fruktozowych, cukru inwertowanego, trehalozy oraz oligosacharydów o korzystnych właściwościach funkcjonalnych i prebiotycznych. Są one często stosowane w postaci immobilizowanych preparatów scharakteryzowanych w rozdziale 6.4.

Innymi często stosowanymi hydrolazami są enzymy proteolityczne mające największy udział w światowej produkcji preparatów enzymatycznych. Wynika to z ich przydatności w przemyśle spożywczym, farmaceutycznym, tekstylnym, garbarstwie, produkcji środków piorących oraz utylizacji białkowych produktów ubocznych (Tabela 3). Przy tak dużej różnorodności wytwarzanych produktów i stosowanych surowców niezbędne są preparaty różniące się selektywnością oraz odpornością na warunki reakcji.

Tabela 3. Niektóre zastosowania enzymów proteolitycznych

Przemysł mleczarski:
	Strącanie kazeiny za pomocą chymozyny i enzymów o podobnym działaniu. Wytwarzanie dietetycznych i przyprawowych hydrolizatów mlecznych. Stabilizacja i poprawianie zwilżalności mleka w proszku. Zapobieganie zapachowi utlenionego mleka. Kształtowanie smaku i zapachu serów dojrzewających.
Przetwórstwo mięsa:
	Przyśpieszanie dojrzewania i poprawa kruchości mięsa. Odzyskiwanie resztek mięsa z kości. Ułatwianie oddzielania tłuszczu. Produkcja bezbarwnych hydrolizatów białkowych z krwinek oddzielonych od plazmy. Zmiękczanie i depilacja skór.
Przemysł rybny:
	Przyśpieszenie dojrzewania ryb solonych i marynowanych. Otrzymywanie jadalnych lub paszowych hydrolizatów białkowych. Ułatwienie wytwarzania mączki paszowej z odcie-ków przez zmniejszenie ich lepkości.
Piekarstwo i przemysł przetworów zbożowych:
	Skrócenie miesienia i ułatwienie mechanicznej obróbki ciasta. Polepszenie tekstury oraz pulchności chleba. Poprawianie strawności i jakości przetworów.
Piwowarstwo:
	Zapobieganie zmętnieniu piwa wskutek strącania białek w obniżonej temperaturze. Ułatwienie filtracji. Kształtowanie zapachu i spienienia piwa. Ulepszenie słodowania.
Przemysł peptonów mikrobiologicznych:
	Wytwarzanie rozmaitych peptonów z odpadowych surowców mięsnych i rybnych.
Przetwórstwo soi:
	Wytwarzanie fermentowanych przetworów, hydrolizatów i preparatów o dobrej zdolności pienienia, zastępujących białko jaja kurzego.

Enzymy proteolityczne dzielą się na: endopeptydazy, nazywane też proteinazami lub proteazami, które atakują wiązania peptydowe (amidowe) wewnątrz cząsteczek oraz egzopeptydazy, wśród których wyróżnia się aminopeptydazy i karboksypeptydazy działające odpowiednio na wiązania przylegające do N- lub C-końca polipeptydu. Charakterystyczną cechą enzymów proteolitycznych jest uzależnienie ich aktywności od rodzaju aminokwasów tworzących rozszczepiane wiązanie. Zmieniając enzym można więc z tego samego surowca wytworzyć produkty różniące się właściwościami i możliwym do osiągnięcia stopniem depolimeryzacji. Niekiedy pożądana jest obróbka termiczna surowca. Stosuje się ją w przypadku proteinaz źle działających na natywne białko z powodu zawady przestrzennej utrudniającej kontakt biokatalizatora z niektórymi wiązaniami udostępnianymi dopiero po denaturacji białka.

Użyteczność enzymu zależy od jego rodzaju. Ze względu na mechanizm katalizowanej reakcji rozróżnia się proteinazy serynowe, tiolowe, aspartylowe oraz metaloproteinazy. Różnią się one stabilnością, odpornością na oddziaływanie inhibitorów oraz wrażliwością na kwasowość środowiska reakcji. Proteinazy serynowe aktywne w alkalicznym środowisku (pH 7-11) są np. przydatne jako składnik środków piorących. Do katalizy w kwaśnym środowisku należy natomiast stosować enzymy aspartylowe, aktywne dopiero przy pH poniżej 5,0. Proteinazy tiolowe nie powinny być używane w środowisku utleniającym lub zawierającym substancje blokujące grupy tiolowe centrum aktywnego. Pożądane jest też kompleksowanie jonów metali przyśpieszających reakcje utleniania oraz reaktywowanie enzymu cysteiną, stosowaną z tego powodu jako aktywator papainy. Chelatory, np. sól sodowa kwasu diaminotetraoctowego (EDTA), wywołują natomiast inaktywację metaloproteinaz, a zmniejszenie ich aktywności może nastąpić pod wpływem jonów metali zastępujących Zn²⁺ w centrum aktywnym enzymu.

Hydroliza katalizowana enzymami proteolitycznymi zmienia właściwości białek wskutek zniszczenia pierwotnej struktury cząsteczek oraz fragmentacji łańcucha polipeptydowego. Otrzymany produkt jest zmodyfikowanym białkiem w przypadku gdy stosowano enzym o dużej selektywności i nastąpiło rozszczepienie niewielu wiązań lub hydrolizatem białkowym wytworzonym wskutek zaawansowanej depolimeryzacji, której produktem jest mieszanina wolnych aminokwasów i peptydów. Przykładem procesu polegającego na modyfikacji białka jest strącanie skrzepu kazeinowego wskutek oddzielenia hydrofilowego makropeptydu z cząsteczki κ-kazeiny. Reakcję katalizuje stosowana do produkcji serów chymozyna, atakująca selektywnie wiązanie peptydowe -Phe(105)-Met(106)-. Dobierając enzym wytwarzający peptydy z resztami hydrofobowymi na N- lub C- końcu cząsteczki można uniknąć gorzkiego smaku hydrolizatów białkowych wytwarzanych z niektórych surowców. Łagodną hydrolizę stosuje się też do wywołania korzystnych zmian rozpuszczalności, skuteczności wiązania wody, strukturyzowania, zdolności emulgowania i tworzenia piany oraz innych właściwości funkcjonalnych białek (Tabela 4). Zależą one od selektywności działania enzymu i od ilości rozszczepionych wiązań peptydowych określanej stopniem hydrolizy (DH). Jego miarą jest procentowy udział azotu aminowego w ogólnej zawartości azotu w hydrolizacie. Produkowane obecnie preparaty są przeważnie endopeptydazami atakującymi wiązania pomiędzy resztami rozmaitych aminokwasów. Stosowane są także egzopeptydazy między innymi w celu przyśpieszenia reakcji Maillarda wywołanego uwalnianiem aminokwasów reagujących z cukrami redukującymi. Aminopeptydazy są też wykorzystywane do usuwania zmętnienia piwa, produkcji sosów sojowych oraz katalizowania hydrolizy białek podczas dojrzewania serów i ryb solonych. Karboksypeptydazy o dużej specyficzności służą do regulowania właściwości funkcjonalnych hydrolizatów oraz do wstępnej hydrolizy białek sojowych w celu usunięcia niepożądanych związków zapachowych i lipidów.

Tabela 4. Zmiany niektórych właściwości funkcjonalnych wywołane hydrolizą białek

Właściwość	Zmiany wywołane enzymatyczną hydrolizą:
Rozpuszczalność	Zwiększenie rozpuszczalności Zanik strącania w punkcie izoelektrycznym lub podwyższonej temperaturze Utrata zdolności wysalania, nawet w obecności dwu-wartościowych kationów Zmniejszenie lepkości roztworów
Zdolność emulgowania	Przejściowy wzrost zdolności emulgowania w przypadku gdy hydroliza zwiększa hydrofobowość powierzchniową Zmniejszenie zdolności emulgowania przy dużym stopniu hydrolizy powodującym rozkład peptydów zawierających zarówno domeny hydrofilowe i hydrofobowe
Zdolność żelowania	Zanik zdolności żelowania przy masie cząsteczkowej poniżej 23 kDa Wzrost zdolności żelowania przy małym stopniu hydrolizy, jeśli zmiana struktury cząsteczek ułatwia późniejsze wytworzenie wiązań disulfidowych
Tekstura	Zwiększenie kruchości mięsa wskutek fragmentacji białek miofibrylarnych. Poprawa elastyczności i rozciągliwości ciasta wskutek częściowej hydrolizy białek frakcji glutenu

Duże znaczenie ma możliwość zmiany kierunku reakcji katalizowanych enzymami proteolitycznymi (reakcja plasteinowa) wskutek zwiększenia stężenia substratu i obniżenia aktywności wody. Syntetyzuje się w ten sposób niektóre peptydy oraz wbudowuje aminokwasy poprawiające wartość żywieniową produktu i jego właściwości funkcjonalne.

Do katalizy plasteinowania przydatne są termostabilne enzymy ze względu na ich dużą odporność na działanie rozpuszczalników organicznych dodawanych w celu obniżenia aktywności wody w środowisku reakcji. Innym możliwym zastosowaniem termostabilnych proteaz jest tenderyzacja (kruszenie) mięsa. Wynika to z małej aktywności tych enzymów w obniżonej temperaturze. Przykładem jest kaldolizyna, której aktywność w 20 °C wynosi zaledwie 1,3 % wartości osiąganej w 75 °C. Wstrzyknięte do mięsa proteazy z mezofili działają przez cały okres przechowywania, co prowadzi do nadmiernej fragmentacji miofibryli. Zastosowanie enzymu aktywnego tylko podczas termicznej obróbki mięsa pozwala na szybkie zahamowanie reakcji po ochłodzeniu produktu.

Zaawansowana hydroliza katalizowana enzymami o szerokiej specyficzności jest często wykorzystywana do utylizacji odpadów roślinnych zawierających białka (np. otręby zbóż) lub materiałów, które zawierają pozostałość trudnej do usunięcia tkanki mięśniowej. Stosuje się ją także do usuwania alergennego oddziaływania niektórych białek. Korzystną cechą hydrolizatów białkowych są ich właściwości przeciwutleniające spowodowane oddziaływaniem niektórych wolnych aminokwasów i oligopeptydów (zbudowanych z dwóch do pięciu reszt aminokwasowych). Hydrolizaty stosowane jako przeciwutleniacze nie powinny jednak zawierać zbyt dużo wolnych aminokwasów, które przy nadmiernym stężeniu mogą działać jako prooksydanty. Wytworzone hydrolizaty są między innymi składnikiem:

• odżywek dla alergików, sportowców i osób ze schorzeniami przewodu pokarmowego;

• preparatów mlekozastępczych;

• preparatów do odżywiania dożylnego;

• żywności dla rekonwalescentów i osób starszych;

• szamponów, kremów i pudrów;

• past czyszczących;

• podłoży mikrobiologicznych;

• napojów owocowych o zwiększonej wartości odżywczej.

W przetwórstwie surowców tłuszczowych duże znaczenie mają lipazy (EC 3.1.1.3) należące do klasy hydrolaz serynowych katalizujących rozszczepienie wiązań estrowych w mono-, di- oraz triacyloglicerolach. Charakterystyczną cechą lipaz odróżniającą je od innych esteraz jest większa aktywność względem nierozpuszczalnych substratów niż w przypadku stosowania reagentów rozpuszczalnych w wodzie. Lipazy są stosowane do syntezy estrów, przeciwutleniaczy, emulgatorów, związków smakowo zapachowych, farmaceutyków, oraz do produkcji modyfikowanych lipidów oraz innych substancji o dużej przydatności. Użyteczność lipaz do wytwarzania tych wyrobów wynika między innymi z możliwości katalizowania estryfikacji i transestryfikacji w prawie bezwodnym środowisku ich regio- i stereospecyficzności oraz aktywności względem nierozpuszczalnych substratów. Ze względu na specyficzność wyróżnia się lipazy rozszczepiające wszystkie wiązania estrowe w cząsteczce triacyloglicerolu, działające tylko na wiązania w pozycjach 1 i 3 lub lipazy katalizujące hydrolizę wiązania nr 2. Niektóre lipazy są specyficzne tylko dla krótko- albo długołańcuchowych kwasów tłuszczowych lub kwasów z wiązaniami podwójnymi. Ma to duże znaczenie np. dla kształtowania aromatu charakterystycznego dla różnych gatunków serów dojrzewających, uzyskiwanego po przekształceniu uwolnionych kwasów tłuszczowych w ketony, ketokwasy, laktony i inne związki zapachowe. Lipazy wykazują także selektywność względem kwasów o określonej konformacji (cis- trans-) lub ilości wiązań podwójnych w cząsteczce.

Przemysł spożywczy stosuje lipazy do przyśpieszenia dojrzewania serów, produkcji koncentratów zapachowych i mleka w proszku, polepszania smaku wyrobów cukierniczych i do hydrolizy pozostałości tłuszczu w albuminie jaj, co poprawia jej zdolności pianotwórcze. Duża stereospecyficzność niektórych lipaz jest wykorzystywana do syntezy enancjomerycznie czystych leków. Mało specyficzne lipazy są natomiast użyteczne jako składnik środków piorących. Dostępne w handlu preparaty są najczęściej produkowane z udziałem Aspergillus niger, Candida rugosa lub Rhizomucor miehei. W niektórych procesach (przedstawionych w rozdziale 6.4) są one wykorzystywane w formie immobilizowanej.

W technologii żywności są też stosowane pektynazy i niektóre oksydoreduktazy. Pektynazy wykorzystuje się do poprawy klarowności i zwiększenia wydajności tłoczenia soków oraz ułatwienia ich filtracji. Oksydaza glukozowa (EC 1.1.3.4) jest stosowana w celu utlenienia glukozy w proszku jajecznym, co zapobiega jego brunatnieniu wskutek reakcji Maillarda. Enzym ten jest także przydatny do usuwania tlenu z opakowań oraz stabilizacji piwa, win i soków. Katalaza (EC 1.11.1.6) służy natomiast do rozłożenia nadtlenku wodoru wytwarzanego podczas utlenienia glukozy lub dodawanego podczas chemicznej sterylizacji mleka lub wybielania serów.

Enzymy znajdują także duże zastosowanie w analityce. Stosowane są w tym celu preparaty o dużej specyficzności umożliwiającej oznaczenie określonego analitu w mieszaninie wielu, często bardzo podobnych substancji. Budowę i działanie wykorzystywanych w tym celu biosensorów z immobilizowanymi enzymami przedstawiono w rozdziale 6.4.

16

Zawiesina ziaren skrobi

(30-40 %, w/v) pH 3.2 - 4.5

Regulacja kwasowości do

pH 6.5

Roztwór NaOH

Upłynnianie skrobi (I)

105 °C 5 - 10 min

α - Amylaza

Upłynnianie skrobi (II)

90 °C 3 - 4 godz

α - Amylaza

Zakwaszanie pH 4.5

Roztwór HCl

Scukrzanie

55 - 60 °C 48 - 96 godz

Glukoamylaza

Odbarwianie

Nierozpuszczalna pozostałość

Odsalanie

Zagęszczanie

Wymieniacz

jonowy

Syrop glukozowy

Rys.2. Schemat otrzymywania syropów glukozowych

Para wodna

Adsorbent

Filtracja

Opary

---