Sprawozdanie nr 3

Wyznaczanie optymalnego stężenia TTC oraz wyznaczanie toksyczności (test TTC)

BioAut2

• Klaudia Zelga

• Arleta Major

• Weronika Marszałek

• Aleksandra Kukowka

Cel ćwiczeń: Wyznaczanie optymalnego stężenia chlorku 2,3,4-trójfenylotetrazolowego podczas oznaczania aktywności dehydrogenaz za pomocą testu TTC. Wyznaczanie toksyczności za pomocą testu TTC.

Wykonanie, obliczenia i wnioski:

1. Wyznaczanie optymalnego stężenia chlorku 2,3,4-trójfenylotetrazolowego podczas oznaczania aktywności dehydrogenaz za pomocą testu TTC.

Do oznaczonych probówek wirowych wprowadziłyśmy następujące objętość [ml] reagentów:

Reagenty	Probówki (każda próbę robimy podwójnie)
	1	2	3	4	5	6	7	8
Roztwór Na2SO3	1	1	1	1	1	1	1	1
H20	0,9	0,8	0,7	0,6	0,5	0,3	0,2	-
Roztwór TTC	0,1	0,2	0,3	0,4	0,5	0,7	0,8	1
Osad czynny	8	8	8	8	8	8	8	8

Po wprowadzeniu reagentów zawartość probówek wymieszałyśmy, a następnie nasze probówki odłożyłyśmy do inkubacji w ciemności w temperaturze pokojowej na 30 min. Po zakończeniu inkubacji próbki odwirowałyśmy (probówki wirowały się do 3000 obrotów na minutę), następnie odrzuciłyśmy supernatant, a następnie dla przerwania reakcji enzymatycznych i ekstrakcji TF wprowadziłyśmy do próbówek po 4 ml alkoholu metylowego w takiej samej kolejności i zachowując podobne tempo jak przy wprowadzaniu roztworu TTC. Próbki energicznie wytrząsnęłyśmy i ponownie odstawiłyśmy do wirowania. Na samym końcu oznaczyłyśmy ekstynkcję cieczy nadosadowej przy długości fali 485 nm.

Nr probówki	Ekstynkcja	Wartość średnia ekstynkcji
1	0,743	0,722
1	0,701
2	0,822		0,863
2	0,903
3	0,341*		0,804
3	0,804
4	0,680		0,721
4	0,761
5	0,611		0,509
5	0,406
6	0,498		0,498
6	0,810*
7	0,789*		0,492
7	0,492
8	0,536		0,533
8	0,529

* wartości odrzucone

Maksymalna wartość na wykresie (zaznaczona czerwonym punktem) jest równa 10% stężeniu TTC co oznacza, że optymalne stężenie TTC, które będzie stosowane we właściwych oznaczeniach aktywności dehydrogenaz mikroorganizmów wynosi 10%

2. Wyznaczanie toksyczności za pomocą testu TTC

W tym celu do 16 oznakowanych probówek wirówkowych wprowadziłyśmy podane w poniższej tabeli objętości [ml] reagentów:

Reagenty		Probówki (każda próbę robimy podwójnie)
		1	2	3		4	5	6		7	8
Roztwór Na2SO3		1	1	1		1	1	1		1	1
Roztwór TTC		1	1	1		1	1	1		1	1
Rezorcyna 3%		-	0,1	0,2		0,3	0,4	0,6		0,8	1
H20		1,0	0,9	0,8		0,7	0,6	0,4		0,2	-
Osad czynny	7		7		7	7	7		7	7		7

Następnie wykonywałyśmy czynności takie same jak w podpunkcie A z jedna zmianą. Zamiast 4 ml metanolu dodałyśmy 8 ml metanolu.

TABELA Z WYNIKAMI I OBLICZENIAMI

Nr próbki	E- ekstynkcja	średnia ekstynkcja	TF	AD	ST- doświadczalne	C^T[%]	1/ST	1/C^T	ST-teoretyczne
1	0,235	0,2365	5,4057143	10,8114286*	0	0	0	0	0
1	0,238
2	0,181									0,2	4,5714286	9,14285714	0,154334038	0,03	6,47945205	33,333333	0,121875
2	0,219
3	0,193									0,202	4,6171429	9,23428571	0,145877378	0,06	6,85507246	16,666667	0,205263158
3	0,211
4	0,076									0,195	4,4571429	8,91428571	0,175475687	0,09	5,69879518	11,111111	0,265909091
4	0,195
5	0,143									0,153	3,4971429	6,99428571	0,353065539	0,12	2,83233533	8,3333333	0,312
5	0,163
6	0,148									0,1465	3,3485714	6,69714286	0,380549683	0,18	2,62777778	5,5555556	0,377419355
6	0,145
7	0,141									0,115	2,6285714	5,25714286	0,513742072	0,24	1,94650206	4,1666667	0,421621622
7	0,089
8	0,106									0,1105	2,5257143	5,05142857	0,532769556	0,3	1,87698413	3,3333333	0,453488372
8	0,115

Wszystkie obliczenia zostały wykonane w Excelu na podstawie poniższych wzorów:

TF= E*20*(8/7)

AD= TF/t

ST= (AD₀-AD_T)/AD₀

C^T - obliczone z proporcji

ST=STmax(C^T/(K+C^T))

1

Wartość STmax:

1/STmax = „oy”

1/STmax = 1,55

STmax = 0,65

Wartość K:

-1/K = „ox”

-1/K = -8

K = 0,13

2

3.

Wnioski:

Na podstawie wykresu 1 obliczyłyśmy STmax = 0,65 i K = 0,13.

Porównując wykresy 2 i 3 dochodzimy do wniosku, że nasze wyniki nieznacznie odbiegają od wyników teoretycznych. Błędy które uzyskałyśmy mogą być spowodowane nie dokładnym wykonaniem pomiarów oraz naszym brakiem doświadczenia.

Dla dobra doświadczenia oraz opracowanych późniejszych wyników odrzuciłyśmy kilka wartości zarówno z pierwszej części doświadczenia - po jednej wartości z próby 4, 6, 7 oraz z drugiej części doświadczenia - jedna z próby 4.

Kolorem czerwonym na wykresach 2 i 3 zaznaczyłyśmy wartość STmax , K i ½STmax. Z obu wykresów wynika, że wartość STmax jak i K zostały dobrze obliczone i punkt styku między ½ STmax i K zawiera się na krzywej wyznaczonej przez otrzymane przez nas punkty.

---