Technologia Żywności i Żywienie Człowieka

Sem. V gr. 3

Czwartek 12¹⁵-16⁰⁰

Laboratorium z Biochemii

Ćwiczenie nr 8

Oksydoreduktazy

Wstęp teoretyczny

Oddychanie komórkowe - są to łączne procesy enzymatyczne przebiegające w każdej komórce żywego organizmu, w których wyniku cząsteczki węglowodanów, kwasów tłuszczowych i aminokwasów zostają ostatecznie rozłożone na dwutlenek węgla i wodę, a powstająca energia zostaje zachowana i zmagazynowana w postaci użytecznej biologicznie.

W utlenianiu biologicznym zachodzą różne typy reakcji oksydoredukcyjnych: przenoszenie tlenu, przenoszenie protonów i elektronów oraz przenoszenie samych elektronów.

Oksydoreduktazy (EC 1) -enzymy katalizujące reakcje utleniania i redukcji.

Oksydoreduktazy przenoszą elektrony z jednej cząsteczki (utleniacz) na inną (reduktor).

Wiele z tych enzymów znanych jest jako:

• dehydrogenazy

• oksydazy

• peroksydazy

• oksygenazy

• katalazy

Dehydrogenazy to ogólna nazwa enzymów odczepiających atomy wodoru (łac. hydrogenium - wodór) z rozmaitych związków organicznych występujących w organizmach żywych. Przykładem może być kompleks dehydrogenazy kwasów tłuszczowych czy enzymy cyklu Krebsa. Odrywany atom wodoru nie występuje w postaci rodnika tylko jest wiązany z NADP i tak używany do hydrogenacji (uwadaraniania) albo spalany w kaskadzie oksydacyjnej mitochondrium produkując ATP~P~P.

Dehydrogenaza alkoholowa (EC 1.1.1.1) - enzym z grupy oksydoreduktaz przyspieszający przekształcanie się aldehydu octowego w etanol lub odwrotnie. Może także katalizować podobne przemiany innych alkoholi i odpowiadających im aldehydów i ketonów.

Enzym ten odgrywa podstawową rolę w fermentacji alkoholowej, która jest formą oddychania beztlenowego, a także w detoksykacji alkoholu.

Dehydrogenaza alkoholowa występuje bardzo powszechnie - w komórkach bakterii, grzybów, zwierząt i roślin. Współdziała z cząsteczką NAD+ lub NADH jako koenzymem. W reakcji syntezy etanolu z aldehydu octowego, zużywany jest NADH, a jako produkt uboczny powstaje NAD+):

Dyhydrogezana mleczanowa (EC 1.1.1.2) - enzym z klasy oksydoreduktaz, obecny w wątrobie. Katalizuje ostatni etap szlaku glikolitycznego - przejście pirogronianu w mleczan i odwrotnie.

Katalizuje utlenienie kwasu mlekowego, odgrywa ważną rolę w fermentacji mlekowej.

Reduktazy - to grupa enzymów obniżających energię aktywacji związku chemicznego dla reakcji redukcji. Pozwala to na przeprowadzenie reakcji przy doprowadzeniu mniejszej niż normalnie ilości energii.

Reduktazy katalizują przeniesienie protonów i elektronów lub samych elektonów pomiędzy przenośnikami np. wewnątrz łańcucha oddechowego. Enzymem tego typu jest reduktaza azotanowa, katalizująca redukcję azotanów do azotynów.

Oksygenazy - enzymy katalizujące proces wbudowania tlenu w cząsteczkę.

Wyróżniamy:

1. oksygenazy właściwe (dioksygenazy) -włączają dwa atomy tlenu do substratu;

- dioksygenazy wymagające udziału NAD(P)H, katalizujące reakcje hydroksylacji substratu;

- dioksygenazy niewymagające udziału NAD(P)H, katalizujące rozerwanie pierścienia;

b) oksygenazy mieszane (monoksygenazy) -katalizują włączenie jednego atomu tlenu do hydroksylowanego substratu, podczas gdy drugi atom tlenu wiązany jest w cząsteczkę wody z udziałem NAD(P)H.

Oksydazy - enzymy katalizujące przenoszenie wodoru na tlen w wyniku, czego powstaje woda lub nadtlenek wodoru.

Wyróżniamy:

• oksydazy pierwszego zespołu - produktem jest woda (np. oksydaza cytochromowa - posiada grupę prostetyczną w postaci dwóch grup hemowych)

Aktywują cząsteczkę tlenu czterema elektronami:

Oksydaza cytochromowa jest szeroko rozpowszechnioną w wielu tkankach hemoproteiną, zawierającą jako grupę prostetyczną typowy hem występujący w mioglobinię, hemoglobinie i innych cytochromach. Jest ona końcowym przenośnikiem elektronowym w mitochondrialnym łańcuchu oddechowym. Jest odpowiedzialny za reakcje przenoszenia elektronów pochodzących z utleniania cząsteczek substratów katalizowanych przez dehydrogenazy, na ich końcowy akceptor - tlen. Oksydaza traci aktywność w obecności tlenku węgla II, cyjanków lub siarkowodoru. Zawiera on dwie cząsteczki hemu, z których każdy posiada atom Fe, występujący w czasie utleniania i redukcji w formie Fe³⁺ i Fe²⁺. Po zatem enzym ten zawiera dwa atomy miedzi po jednym na jednostkę hemową.

oksydazy fenolowe (charakterystyczne dla roślin) - katalizujące utlenianie fenoli do chitonów.

Jest to enzym o małej specyficzności i działa na o-fenole, ale także na inne substraty fenolowe. Oksydaza o-difenolowa utlenia te związki do odpowiednich o-chinonów, które ulegają dalszym przemianom i polimeryzacji już bez udziału enzymów do tzw, melanin, charakteryzujących się barwą brunatną. Zmiany spowodowane przemianami polifenoli zapoczątkowane ich utlenieniem do chitonów w obecności oksydaz fenolowych noszą nazwę „enzymatycznego brunatnienia lub enzymatycznego brązowienia żywności”. Bogatym źródłem oksydazy o-difenolowej są niektóre owoce (jabłka, banany) i warzywa (ziemniaki).

• oksydazy drugiego zespołu - produktem jest nadtlenek wodoru np. oksydaza ksantynowa - posiada koenzym w formie FAD lub FMN

Aktywują cząsteczkę tlenu dwoma elektronami:

Oksydaza glukozowa utlenia glukozę do kwasu glukozowego. Enzym ten wykazuje powinowactwo do β-D-glukopiranozy. Oksydazę glukozową stosuje się do ilościowego oznaczania glukozy w żywności, we krwi i w moczu, a także do usuwania glukozy z produktów spożywczych oraz do usuwania tlenu z puszek z konserwami, piwem czy też z opakowań foliowych.

Enzymy rozkładające nadtlenek wodoru

Nadtlenek wodoru tworzy się w wyniku aktywacji tlenu dwoma elektronami z udziałem oksydaz lawinowych. Ponieważ H₂O₂ jest silnym inhibitorem układów enzymatycznych, organizmy mają aktywne mechanizmy zdolne do jego rozkładu. Do enzymów czynnych przy usuwaniu H₂O₂ z komórki należą peroksydazy i katalazy. Enzymy te są żelazoproteinami i zawierają hem jako grupę prostetyczną.

Peroksydazy (np. EC 1.11.1.7) - grupa enzymów należących do klasy oksydoreduktaz katalizujących utlenianie nadtlenkiem wodoru różnych substratów. Choć reakcja katalizowana przez peroksydazę jest złożona można ją zapisać w następującej formie:

Peroksydaza glutationowa, jak i askorbinionowa wspomaga organizm w walce z wolnymi rodnikami. Peroksydaza glutationowa rozkłada nadtlenek wodoru (H₂O₂) do wody (H₂O).

Katalaza - (EC 1.11.1.6) enzym z grupy oksydoreduktaz katalizujący proces rozkładu nadtlenku wodoru do wody i tlenu.

Otrzymana po raz pierwszy w postaci krystalicznej w 1937 roku przez J.B. Sumnera. Znaczne jej ilości występują w komórkach zwierzęcych np. w wątrobie, nerce, leukocytach i erytrocytach (krwinkach czerwonych), w bakteriach tlenowych oraz w peroksysomach komórek roślinnych fotosyntezujących. Jest dobrym enzymem markerowym dla peroksysomów. Jest bardzo aktywnym enzymem, którego grupę prostetyczną stanowi hemina.

Wykonanie doświadczenia:

1. Przygotowanie ekstraktu enzymatycznego.

Ziemniaka obrałyśmy ze skórki i starłyśmy na tarce. Naważkę 10g przygotowanego produktu roztarłyśmy w moździerzu z dodatkiem 1g CaCO₃ do uzyskania jednorodnej masy. Próbę przeniosłyśmy ilościowo do cylindra o pojemności 200cm³, uzupełniłyśmy do kreski wodą destylowaną, wymieszałyśmy i po 5min przesączyłyśmy. Ekstrakt stosowałyśmy do dalszych doświadczeń.

2. Analiza jakościowa

1. Wykonanie oznaczenia:

Przygotowałyśmy 8 probówek:

Próba odniesienia (probówka 1):

Do 2cm³ ekstraktu enzymatycznego dodałyśmy 3cm³ wody destylowanej.

Oksydaza o-difenolowa (probówki 2 i 3):

Do obu probówek dodałyśmy 2cm³ ekstraktu enzymatycznego i 3cm³ wody destylowanej. Następnie do probówki 2 dodałyśmy 10 kropli 1% katecholu, a do probówki 3 dodałyśmy 10 kropli 1% pirogalolu.

Peroksydaza (probówki 4 i 5):

Do obu probówek dodałyśmy 2cm³ ekstraktu enzymatycznego i 3cm³ wody destylowanej. Następnie do probówki 4 dodałyśmy 10 kropli 1% katecholu i 10 kropli 1% H₂O₂, a do probówki 5 dodałyśmy 10 kropli 1% pirogalolu i 10 kropli 1% H₂O₂.

Katalaza (probówka 6):

Do 2cm³ ekstraktu enzymatycznego dodałyśmy 3cm³ wody destylowanej i 10 kropli 1% H₂O₂.

Próby odczynnikowe (probówki 7 i 8):

Do obu probówek wprowadziłyśmy 5cm³ wody destylowanej. Następnie do probówki 7 dodałyśmy 10 kropli 1% katecholu, a do probówki 8 dodałyśmy 10 kropli 1% pirogalolu.

Zawartość probówek wymieszałyśmy i obserwowałyśmy zachodzące zmiany w czasie 3 godzin.

Wyniki analizy jakościowej aktywności oksydazy o-difenolowej, peroksydazy, katalazy w badanym surowcu, zestawiłyśmy w tabeli:

Nr probówki	Próba	Oznaczany enzym	Wynik analizy	Opis próby
1	Ekstrakt	Próba odniesienia	-	Bezbarwny
2 3	Ekstrakt + katechol Ekstrakt + pirogalol	Oksydaza o-difenolowa	++ ++	Pomarańczowy Jasnożółty
4 5	Ekstrakt + katechol + H2O2 Ekstrakt + pirogalol + H2O2	Peroksydaza	+++ +++	Jasnobrązowy + gaz Intensywny żółty + gaz
6	Ekstrakt + H2O2	Katalaza	+	Bezbarwny + gaz
7 8	Woda + katechol Woda + pirogalol	Próby odczynnikowe	- -	Bezbarwny Kremowy

Wnioski: W ziemniakach występują następujące enzymy: oksydaza o-difenolowa, peroksydaza i katalaza. Peroksydaza wykazuje bardzo wysoką aktywność spośród analizowanych enzymów oksyredukcyjnych w ziemniaku. Oksydaza o-difenolowa wykazuje wysoką, a katalaza średnią aktywność.

3. Analiza ilościowa

1. Oznaczenie aktywności katalizy:

W dwóch kolbach stożkowych o pojemności 200cm³ umieściłyśmy 5cm³ ekstraktu enzymatycznego (z ziemniaka) i po 25cm³ wody destylowanej. Do jednej z kolb, służącej o przygotowania próby właściwej, dodałyśmy 3cm³ 1% H₂O₂ i powadziłyśmy reakcję rozkładu nadtlenku wodoru pod wpływem katalazy dokładnie 30 minut w temperaturze pokojowej. Następnie do tej kolby dodałyśmy 5cm³ 10% H₂SO₄, co spowodowało inaktywacje enzymów i przerwanie reakcji enzymatycznego rozkładu H₂O₂. Do drugiej kolby, służącej do przygotowania próby odniesienia, najpierw dodałyśmy 5cm³ 10% H₂SO₄, celem inaktywacji enzymów, enzymów następnie dodałyśmy 3cm³ 1% H₂O₂.

Obie próby zmiareczkowałyśmy 0,1M KMnO₄.

Aktywność katalazy

a - ilość 0,1M KMnO₄ zużyta do miareczkowania próby odniesienia [cm³] = 31cm³

b - ilość 0,1M KMnO₄ zużyta do miareczkowania próby właściwej [cm³] = 11cm³

V_ekstr - całkowita objętość ekstraktu enzymatycznego [200cm³]

V_enz - objętość ekstraktu enzymatycznego pobrana do oznaczenia [5cm³]

c - miano KMnO₄, równe 250, gdyż 1cm³ 0,1M KMnO₄ odpowiada 250 µmoli H₂O₂

t - czas reakcji

m _prod - naważka produktu (10g), z której uzyskano 200cm³ ekstraktu

2. Oznaczenie aktywności peroksydazy:

W probówkach umieściłyśmy:

Próba kontrolna:

5cm³ buforu fosforanowego

1cm³ roztworu gwajakolu

1cm³ ekstraktu enzymatycznego (z kapusty białej)

Próba właściwa:

5cm³ buforu fosforanowego

1cm³ roztworu gwajakolu

1cm³ ekstraktu enzymatycznego (z kapusty białej)

2 krople H₂O₂ 12.3 mM

Zmierzyłyśmy absorbancję próby właściwej wobec kontrolnej przy λ = 436nm w czasie zerowym (A₀) i po 1 minucie (A_1min).

Aktywność peroksydazy:

ΔA - przyrost absorbancji w czasie 1 minuty (A_1min-A₀ = 0,255-0,085 = 0,17)

V_ekstr - całkowita objętość ekstraktu enzymatycznego (200cm³)

0,1 - współczynnik przeliczeniowy jednostki aktywności

V_enz - objętość ekstraktu enzymatycznego pobrana do oznaczenia (1cm³)

m _prod - naważka produktu (10g), z której uzyskano 200cm³ ekstraktu

3. Wyniki analizy ilościowej:

Aktywność katalazy i peroksydazy w badanych produktach zestawiłyśmy w tabeli:

L.p.	Produkt	Aktywność enzymu [U/g]
				Katalaza		Peroksydaza
					średnia		średnia
1	Brukselka	566,7 596,7	587,1	59,1 90 102	96
2	Kapusta biała	316,7 306,7	311,7	40 26 34 36	36,7
3	Ziemniak	666,7 591,7	629,7
4	Pieczarka	558,3	558,3

Wnioski: Najwyższa aktywność katalazy występuje w ziemniaku, a najniższa w kapuście białej. Najwyższa aktywność peroksydazy występuje w brukselce, a najniższa w kapuście białej. Ogólnie najwięcej enzymów rozkładających nadtlenek wodoru (katalazy i peroksydazy) jest w brukselce.

---