Ćwiczenia z osmolalności:

Nie wiem, czy to też ma być, ale piszcie co macie i tyle. PS- wyniki z drugiej tabelki chyba nie wszystkie są poprawne, o ile pamiętam…

Parametr	A	B	C	D	E
1. osmolalność surowicy	290	305	265	325	324
2. osmolalność moczu	600	70	144	1250	420
3. natremia [mmol/l]	140	141	125	152	142
4. stężenie glukozy mg/dl	90	195	85	105	77
5. stężenie mocznika mg/dl	30	34	34	28	45
6. DZM [ml]	1500	1700	1200	1100	1600

Parametr	A	B	C	D	E
Luka osmolalna	0	6,5	4,6	10,5	28,2
Natremia/osmolalność surowicy	0,48	0,46	0,47	0,47	0,44
Osmolalność moczu/osmolalność surowicy	2,07	0,23	0,54	3,85	1,3
Klirens osmolalności	2,16	0,27	0,45	2,93	1,43
Klirens wolnej wody	-2,15	0,91	-0,45	-2,17	-0,33
Diagnoza	Norma	Cukrzyca	Przedawnienie hipotoniczne	Odwodnienie hipertoniczne	Uremia

13 X 2010

Kolorymetryczny test do oznaczania chlorków metodą z TPTZ

Zasada metody:

Jony chlorkowe reagują z kompleksem rtęci (II) i TPTZ tworząc chlorek rtęci. Uwolniony TPTZ reaguje z jonami żelaza (II) tworząc kompleks o zabarwieniu niebieskim. Zmiana absorbancji mierzona przy 590 nm jest wprost proporcjonalna do stężenia chlorków w badanej próbce.

Materiał badany

Surowica, mocz, PMR.

Parametry oznaczenia:

Długość fali 590 (560-600 nm)

Temperatura 20-37 st. C

Pomiar względem próby ślepej odczynnikowej.

Wykonanie oznaczenia:

Rozcieńczyć surowicę i wzorzec wodą destylowaną w stosunku 1:50, np. 0,01 ml surowicy (wzorca) + 0,500 ml wody destylowanej

	Próba ślepa Odczynnikowa	Próba wzorcowa	Próba badana
Wzorzec	-	0,02 ml	-
Surowica	-	-	0,02 ml
Odczynnik	1 ml	1 ml	1 ml
Wymieszać. Inkubować przez 5 minut (ciemnia). Zmierzyć absorbancję prób wzorcowej i badanej względem próby ślepej odczynnikowej przy 590 nm w ciągu 60 min

Obliczanie wyników:

C= 100 x Abad/Awz [mmol/l]

Zakres wartości referencyjnych:

Surowica 95-108 mmol/l

Mocz 110-225 mmol/l

PMR 119-130 mmol/l

Wynik= 94,8 mmol/l normochloremia

Oznaczanie sodu

Zasada metody

Sód jest wytrącany uranylooctanem magnezu; jony uranylu pozostające w zawiesinie tworzą żółtobrązowy kompleks z kwasem trójglikolowym. Różnica pomiędzy próbą ślepą (bez wytrącania sodu) a badaną jest proporcjonalna do stężenia sodu.

Wykonanie oznaczenia:

Długość fali Hg 365 nm, Hg 405 nm, 410 nm

Temperatura 20-25 st. C

Pomiar wobec próby ślepej

Metoda półmikro	Próba ślepa µl	Próba wzorcowa µl	Próba badana µl
Standard		20
Próba badana			20
Odczynnik [PREC]		1000	1000
Zamknąć probówkę i zamieszać. Pozostawić próbkę na 5 minut. Mieszać energicznie przez około 30 sekund. Pozostawić próbkę na 30 min. Wirować przy wysokich obrotach przez 5-10 min.
Odczynnik [PREC]	20
Odwirowany supernatant		20	20
[RGT]	1000	1000	1000
Zamieszać. Po upływie 5-30 min odczytać absorbancję próby ślepej, próby wzorcowej i próby badanej wobec wody destylowanej przy długości fali 360-410 nm

Obliczenia:

C= 150 x (abs próby ślepej- abs pr. Badanej)/ (abs. Pr. Ślepej- abs. Wzorca) [mmol/l]

Wartości prawidłowe

Surowica 135-155 mmol/l

oznaczanie żelaza- zasada metody

żelazo (Fe 3+) reaguje w środowisku kwaśnym z chromazurolem B (CAB) i CTMA tworząc kompleks barwny. Intensywność zabarwienia mierzona przy 623 nm (620-640 nm) jest wprost proporcjonalna do stężenia żelaza (Fe3+) w badanej próbce.

CTMA- bromek trimetyloaminy cetylu (surfaktant kationowy, grupa hydrofilowa jest jonem dodatnim)

Najlepszym materiałem do oznaczania Fe 3+ jest osocze heparynizowane. Nie stosować EDTA ani cytrynianu!!!

TIBC=3 x cFe (bo 3x rozcieńczenie)

UIBC=TIBC- Fe

Wartości prawidłowe

M 80-150 ug/dl

K 70-140 ug/dl

Wyniki:

TIBC 1 = 330,6 ug/dl

A=390

TIBC 2 = 323,7 ug/dl

Średnia 327 norma

C1= 0,195/0,143 x 100=130,9 ug/dl

C2=0,195 x 830=162 ug/dl

C śr= 146,5 ug/dl

Norma

UIBC= TIBC- Fe= 183,5 ug/dl norma

Do żelaza: nie mam metody przeprowadzenia oznaczenia, co z czym, kiedy, przy jakiej długości itp!!!

Wapń

Zasada metody

Zasada metody opiera się na reakcji:

Wapń+kompleks o-krezoloftaleiny -(środowisko alkaliczne) kompleks wapnia i o-krezoloftaleiny (zabarwienie fioletowe)

Otrzymany kompleks o zabarwieniu fioletowym absorbuje promieniowanie o długości fali 575 nm. Absorbancja jest proporcjonalna do stężenia jonów wapnia w badanej próbce.

Materiał

Surowica lub osocze krwi pobranej na heparynę, bez hemolizy.

Mocz z DZM

Jak najszybciej usunąć surowicę znad skrzepu, ponieważ krwinki czerwone mogą absorbować wapń.

Parametry oznaczenia:

Długość fali 575 nm (570-580 nm)

Temperatura 20-25/ 37 st. C

Odczyt wobec ślepej odczynnikowej

Typ reakcji- end point

Procedura z próbką jako starterem (sample start)

	Ślepa odczynnikowa	Wzorzec	Próba badana
Odczynnik roboczy	1000 ul	1000 ul	1000 ul
Doprowadzić do temperatury roboczej, następnie dodać
Wzorzec		10 ul
Próbka			10 ul
Dokładnie wymieszać. Inkubować 10 min w temperaturze 20-25 st. C lub 5 minut w temperaturze 37 st. C. wyzerować spektrofotometr wobec ślepej odczynnikowej i zmierzyć absorbancję próbki Apr i wzorca Awz. Uzyskana barwa jest stabilna przez 30 min.

Procedura z substratem jako starterem (reagent start)

	Ślepa odczynnikowa	Wzorzec	Próba badana
Odczynnik 1	1000 ul	1000 ul	1000 ul
Doprowadzić do temperatury roboczej, następnie dodać
Wzorzec		10 ul
Próbka			10 ul
Wymieszać dokładnie. Inkubować 5 min w temperaturze oznaczenia. Następnie dodać:
Odczynnik 2	250 ul	250 ul	250 ul
Dokładnie wymieszać. Inkubować 10 min w temperaturze 20-25 st. C lub 5 minut w temperaturze 37 st. C. wyzerować spektrofotometr wobec ślepej odczynnikowej i zmierzyć absorbancję próbki Apr i wzorca Awz. Uzyskana barwa jest stabilna przez 30 min.

Obliczanie wynikó

Stężenie wapnia [mg/dl]=Apr/Awz x stężenie wzorca [mg/dl]

Wartości prawidłowe:

Surowica, osocze 8,5-10,5 mg/dl (2,1-2,6 mmol/l)

Mocz z DZM 100-250 mg/24 h (2,5-6,2 mmol/24h)

Wynik uzyskany 2,04 mmol/l

Hipokalcemia:

• Niedoczynność przytarczyc lub upośledzenie receptora dla PTH

• Zaburzenia gospodarki witaminą D (niedobór lub upośledzenie 25- i/lub 1-hydroksylacji)

• Hipofosfatemia

• Zaburzenia gospodarki magnezowej

Oznaczenia magnezu

Zasada metody

Magnez w środowisku alkalicznym reaguje z błękitem ksylitowym tworząc purpurowy kompleks. Absorbacja mierzon przy 520 nm jest wprost proporcjonalna do stężenia magnezu.

Badanie w:

Surowicy lub osoczu pobranym na heparynę bez śladów hemolizy.

Mocz z DZM zakwasić HCl do pH=1 i rozcieńczyć 1:4. otrzymaną z oznaczenia wartość pomnożyć przez 5.

Wartości prawidłowe:

RBC 2-2,6 mmol/l

Mocz <4 mmol/l

Mocz z DZM 3-5 mmol/l

Odpipetować	Próba ślepa	Próba badana lub standard
Surowica/standard		10 ul
Woda destylowana	10
Odczynnik barwiący	1000 ul	1000 ul
Zmieszać, inkubować 10 min w temp. 20-25 st. C. zmierzyć absorbancję próby badanej i standardu wobec próby ślepej w ciągu 60 min.

Wyniki:

Surowica 1,1 mmol/l (normomagnezemia)

Mocz

0,9 x 5=4,5 mmol/l (hipermagnezuria)

Hipermagnezuria: np. stosowanie leków moczopędnych, hiperaldosteronizm, zmniejszona resorpcja magnezu.

	Próba ślepa	Próba wzorcowa	Próba badana 1 (surowica)	Próba badana 2 (mocz)
Woda destylowana	0,01 ml
Wzorzec		0,01 ml
Surowica			0,01 ml
Mocz rozcieńczony 5x				0,01
Odczynnik barwiący	1 ml	1 ml	1 ml	1 ml
Wymieszać, inkubować 10 min w temp. 20-25 st. C, zmierzyć absorbancję prób badanych i wzorcowej wobec próby ślepej przy długości fali 520 nm.

Fosfor

Zasada metody

W środowisku kwaśnym fosfor nieorganiczny w surowicy wytwarza z molibdenianem kompleks, którego absorbancja przy 340 nm jest proporcjonalna do stężenia fosforanu.

Materiał do badań

Surowica. Nie używać osocza ponieważ antykoagulanty mogą zaniżać wynik.

Wykonanie oznaczenia

Długość fali 340 nm

Temperatura 20-25 st. C

Pomiar w stosunku do próby ślepej

Odpipetować	Próba ślepa	Próba badana/standard
Próba/standard		10 ul
Odczynnik	1000 ul	1000 ul
Zmieszać, inkubować 1 min w temp 20-25 st. C. zmierzyć absorbancję próby badanej i standardu wobec próby ślepej w ciągu 60 min

Obliczenie stężenia fosforu

C=3,2 x A próby/ A standardu [mmol/l]

Wartości prawidłowe: dorośli 0,81-1,62 mmol/l

Wartość 3,56 mmol/l

Hiperfosfatemia

• Wzmożone wchłanianie

• Nadmierna podaż

• Upośledzone wydalanie

• Rozpad tkanek, chemioterapia

Cynk

Cynk w środowisku alkalicznym o pH 8,6 tworzy ze specyficznym odczynnikiem kompleksującym 5-Br-PAPS stabilny kolorymetryczny kompleks, którego intensywność barwy jest proporcjonalna do ilości cynku w próbce.

Wykonanie oznaczenia:

Odpipetować	Próba odczynnikowa	Próba wzorcowa	Próba badana (surowica)
Woda destylowana	0,05 ml
Wzorzec		0,05 ml
Surowica			0,05
Roztwór AC	1 ml	1 ml	1 ml
Wymieszać ostrożnie. Odczytać absorbancję próby badanej wobec próby odczynnikowej przy długości fali 560 nm. Dodać
Odczynnik B	0,1 ml	0,1 ml	0,1 ml
Wymieszać ostrożnie. Odczytać absorbancję próby badanej i próby wzorcowej wobec próby odczynnikowej przy długości fali 560 nm. Uzyskana barwa jest stabilna przez 1h.

Oznaczanie BUN

Zasada metody

Odczynnik służy do ilościowego oznaczania in vitro poziomu mocznika w ludzkiej surowicy. Metoda opiera się na reakcji opisanej przez Take i Schuberta. Aby skrócić i uprościć badanie obliczenia opiera się na twierdzeniu Tiffany'ego i WSP. Że stężenie mocznika jest proporcjonalne do miany absorbancji w określonym, stałym przedziale czasu.

Mocznik+H2O—(ureaza)2NH3 +CO2

NH3+alfa-ketoglutaran+NADH—(GLDH)L-glutaminian +NAD

W środowisku mocznik w obecności ureazy ulega hydrolizie dając amoniak i dwutlenek węgla. W obecności zredukowanego NADH przy udziale dehydrogenazy glutaminianowej GLDH amoniak łączy się z alfa-ketoglutaranem tworząc L-glutaminian. Dodany adenozynodwufosforan służy jako aktywator i stabilizator GLDH. Utlenianiu NADH do NAD towarzyszy spadek absorbancji mierzonej przy 340 nm, który jest proporcjonalny do stężenia mocznika w próbce.

Materiał

Najlepszym materiałem jest niezhemolizowana surowica lub osocze pobrane na EDTA lub heparynę sodową. Nie stosować fluorków jako antykoagulantów. Mocz rozcieńczyć 1:20 wodą destylowaną wolną od amoniaku.

Parametry oznaczenia

Temperatura 37 st. C

Długość fali 340 nm

Wykonanie oznaczenia:

• Odmierzyć 1 ml odczynnika i ogrzać do temperatury reakcji (min. 5 min)

• Wyzerować aparat przy długości fali 340 nm wobec wody destylowanej

• Dodać 10 ul surowicy, wymieszać i inkubować w 37 st. C przez 30 s

• Dokładnie po 30 s. odczytać absorbancję początkową

• Inkubować dalej próbkę w 37 st. C przez 60 sekund

• Dokładnie po 60 sekundach odczytać absorbancję końcową

• Według w.w procedury wykonać oznaczenia zarówno dla prób badanych jak i standardów

• Obliczyć wg wzoru:

BUN mg/dl= abs próbki/ ab stand. X stężenie stand. [mg/dl]

Mocznik (mg/dl)=BUN [mg/dl] x 2,14

Wartości prawidłowe:

BUN 7-18 mg/dl

Mocznik 15-38 mg/dl

	Próba ślepa	Próba badana	Próba wzorcowa
Odczynnik		1 ml	1 ml
Ogrzać do temperatury reakcji 37 st. C przez min. 5 min
Surowica		10 ul
Standard			10 ul
Woda destylowana	1 ml
Inkubować przez 30 s. w temp. 37 Zmierzyć absorbancję początkową A1 próby badanej oraz wzorcowej względem próby ślepej (woda destylowana) przy długości fali 340 nm. Inkubację kontynuować przez 60 sekund w temp. 37. Zmierzyć absorbancję końcową A2 próby badanej oraz wzorcowej względem ślepej przy fali 340 nm

Oznaczenie stężenia kwasu moczowego metodą enzymatyczną

Zasada metody.

Oznaczenie opiera się na metodzie Triverdi i Kabaskaliana w modyfikacji Trindera polegającej na wykrywaniu nadtlenków przy użyciu TBHB. W badaniu zachodzą następujące reakcje:

Kwas moczowy+O2+H2O—(urykaza)alantoina+CO2+H2O2

2H2O2 +THBH+4-AAP—(peroksydaza)chinonoimina+H2O

Kwas moczowy jest utleniany przez urykazę do alantoiny z wytworzeniem nadtlenku wodowu

Nadtlenek wodoru reaguje w obecności peroksydazy z TBHB i 4-AAP tworząc barwnik chinonoiminę. Intensywność tego zabarwienia zmienia absorbancję, która mierzona przy fali 520 nm (520-550 nm) jest wprost proporcjonalna do stężenia kwasu moczowego w próbce.

Parametry oznaczenia

Temperatura 37 st. C

Długość fali 520 (520-550 nm)

Typ reakcji: punkt końcowy

Kierunek reakcji: rosnąca

Wykonanie oznaczenia

Odmierzyć	Próba ślepa	Próba wzorcowa	Próba badana
Odczynnik	1 ml	1 ml	1 ml
Ogrzać do temperatury reakcji (37 st. C) przez co najmniej 5 min
Woda destylowana	0,02 ml
Wzorzec		0,02 ml
Surowica			0,02 ml
Inkubować 5 min w tem. 37 st. C. zmierzyć absorbancję próby wzorcowej i badanem względem ślepej przy długości fali 520 nm. Zabarwienie jest stabilne przez 15 min

Obliczanie wyników:

C= A Bad/A wz x 6,0 mg/dl

Wartości referencyjne:

Surowica, osocze:

M 3,5-7,2 mg/dl

Kobiety 2,6-,60 mg/dl

Dzieci 2,5-5,0 mg/dl

Mocz 250-750 mg/dobę

Metoda enzymatyczna UV oznaczania amoniaku w osoczu

Zasada metody

Amoniak łączy się z alfa-ketoglutaranem i NADH w obecności GLDH tworząc glutaminian i NAD

Spadek absorbancji przy 340 nm jest proporcjonalny do stężenia amoniaku w próbce

Alfa-ketoglutaran+NH3+NADH—(GLDH) glutaminian + NAD+

Materiał do badań:

Osocze (heparyna lub EDTA) niezhemolizowane. Krew powinna być pobrana z żyły bez zakładania stazy i umieszczona w lodzie.

Warunki oznaczenia:

Długość fali 340 nm

Temperatura 25/30/37 st. C

Reakcja punktu końcowego

	Próba ślepa	Próba wzorcowa	Próba badana
Osocze			0,1 ml
Woda destylowana	0,1 ml
Standard		0,1 ml
Roztwór roboczy	1 ml	1 ml	1 ml
Zmieszać i inkubować przez 5 min. Odczytać absorbancję początkową A1 przy 340 nm próby ślepej, wzorcowej i badanej
GLDH	0,01 ml	0,01 ml	0,01 ml
Zmieszać i inkubować przez 5 min. Odczytać absorbancję końcową A2 przy 340 nm próby ślepej wzorcowej i badanej

Obliczanie wyników

C [ug/dl]=(A próby Bad.-A próby ślepej)/(A próby wz. - A próby ślepej) x 500 [ug/dl]

Wartości referencyjne

17-80 ug/dl

Oznaczanie kreatyniny

Metoda z kwasem pikrynowym, bezpośrednia, bez odbiałczania

Materiał badany:

Surowica lub osocze heparynizowane

Mocz rozcieńczony wodą destylowaną 1:49

Wartości prawidłowe

Surowica <= 1,3 mg/dl

Mocz 70-200 ug/dl (DZM 1500 ml); 1-3 g/24 h

Temperatura 25, 30, 37 st. C

Stężenie kreatyniny= A próbki/A wzorca x c wzorca

Po 30 s odczytać A1 próby badanej i wzorcowej wobec śelepj lub wody destylowanej przy 490 nm (490-510 nm). Dokładnie po 2 min odczytać absorbancję A2.

Mocz 1,4 x 50= 70 mg/dl N

Surowica 1,3 mg/dl N

Oznaczanie bilirubiny

Zasada metody

Bilirubina reaguje z dwuazydowym kwasem sulfanilowym tworząc barwnik azowy (czerwony). Absorbancja przy 564 nm wprost proporcjonalna do stężenia bilirubiny. Rozpuszczalne w wodzie glukoniany bilirubiny reagują „bezpośrednio” z DSA, podczas gdy koniugowana z albuminą bilirubina „pośrednia” będzie reagować z DSA w obecnośći przyspieszacza.

Bilirubina +DSA bezpośrednia azobilirubina

Bilirubina+DSA+przyspieszacz całkowita azobilirubina

Materiał do badań:

Surowica, osocze heparynizowane

Nie hemolizowane, przetrzymywanie z dala od światłą!

Wyniki

Bilirubina całkowita

F=13,89

C=0,31 mg/dl norma

Bilirubina bezpośrednia

F=19,27

C=0,1 mg/dl norma

Bilirubina pośrednia

c=0,31-0,1=0,21 mg/dl norma~

Trzeba uzupełnić o wykonanie oznaczenia dla bilirubiny, opisową zasadę metody oznaczania kwasów żółciowych, obliczenia dla kwasów żółciowych i wykonanie dla nich oznaczenia.

---