Laboratorium Przyrodnicze: Chemia

Sprawozdanie z ćwiczeń z dnia 28.03.2014

Ćw. 3: METODY EKSTRAKCJI WIELOPIERŚCIENIOWYCH WĘGLOWODORÓW AROMATYCZNYCH (WWA) Z GLEBY

Przyroda II rok

28.03.2014

1. Wstęp teoretyczny

1. Wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne (WWA)

Wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne (WWA) w literaturze angielskiej znane pod nazwami: polycyclic aromatic hydrocarbons (PAH), polynuclear aromatics (PNAs) lub polycyclic organic matter (POM), stanowią liczną grupę związków zawierających od dwóch do kilku, a nawet kilkunastu pierścieni aromatycznych w cząsteczce. Związków tej grupy jest ponad setka, lecz z uwagi na ich toksyczność, oddziaływanie na człowieka oraz wielkość dostępnych informacji, najczęściej oznaczanych jest 17. Są to: acenaften, acenaftylen, antracen, benzo/a/antracen, benzo/a/piren, benzo/e/piren, benzo/b/fluoranten, benzo/j/fluoranten, benzo/k/fluoranten, benzo/g,h,i/perylen, chryzen, dibenzo/a,h/antracen, fluoranten, fluoren, fenantren, piren i indeno/1,2,3-cd/piren.

2. Źródła pochodzenia WWA

Wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne, występujące w środowisku człowieka, pochodzą głównie ze źródeł antropogennych. W aspekcie ogólnego skażenia, ilości WWA pochodzące ze źródeł naturalnych i stanowiące "naturalne tło" są niewielkie w porównaniu z ilościami będącymi wynikiem działalności człowieka. WWA powstają jako produkty uboczne w wielu procesach chemicznych. Zasadniczo każdy proces, związany z silnym ogrzewaniem lub niecałkowitym spalaniem związków organicznych, może być źródłem emisji WWA, również pozaprzemysłowym (spalarnie odpadów, pożary lasów, spaliny pojazdów mechanicznych).

Odrębnym źródłem WWA jest palenie tytoniu, przy czym zarówno bierne jak i czynne palenie jest istotnym czynnikiem ryzyka nowotworowego. Występowanie WWA we wszystkich elementach środowiska człowieka: w powietrzu, w wodzie, w glebie oraz żywności powoduje, że narażenie na ich działanie ma charakter powszechny. Dostają się do organizmu ludzkiego różnymi drogami: podczas spożywania pokarmów, drogą inhalacyjną oraz przez skórę. Nie ma ilościowych danych na temat absorpcji, dystrybucji i wydalania WWA u ludzi. Informacje na powyższy temat pochodzą głównie z badań eksperymentalnych na zwierzętach.

3. Izolacja WWA

Aby wyizolować węglowodory z gleby stosuje się ekstrakcję cieczą. Do ekstrakcji WWA z gleby stosuje się rozpuszczalniki, w których dobrze rozpuszczają się węglowodory są to najczęściej: n-heksan, cykloheksan, toluen, dichlorometan, aceton oraz ich mieszaniny. W ekstrakcie z gleby znajdują się głównie związki niepolarne jak węglowodory oraz w zdecydowanie mniejszej ilości związków polarnych. W glebach nieskażonych są to głównie łańcuchowe węglowodory nasycone pochodzenia roślinnego, w skażonych - mieszanina nasyconych i aromatycznych o stosunku ilościowym zależnym od stopnia skażenia. Do wydzielenia frakcji WWA z ekstraktu stosuje się bardzo często cieczową chromatografię adsorpcyjną, w której rozdział następuje dlatego, że poszczególne składniki mieszaniny wykazują różnice w adsorpcji zachodzącej na aktywnych powierzchniach adsorbentu (w chromatografii nazywanego fazą stacjonarną). Im substancje wykazują większe powinowactwo do adsorbentu tym bardziej są na nim zatrzymywane i później opuszczają kolumnę chromatograficzną. Oznacza to większą ilość rozpuszczalnika (fazy ruchomej) potrzebną do wymycia ich z kolumny (w chromatografii mówimy o większej objętości retencji).

2. Przebieg doświadczeń

1. Ekstrakcja gleby wspomagana ultradźwiękami

Suchą glebę roztarłyśmy w moździerzu, następnie 20g odpowiednio przygotowanej gleby umieściłyśmy w kolbie stożkowej o pojemności 100ml, do kolby dodałyśmy jeszcze 50ml mieszaniny eteru naftowego oraz dichlorometanu w proporcji objętościowej 3:2. Tak przygotowaną mieszaninę umieściłyśmy na 15 minut w łaźni ultradźwiękowej. Po tym czasie zdekantowałyśmy osad i ekstrakt przesączyłyśmy przez sączek z bezwodnym siarczanem sodu do kolby okroągłodennej o pojemności 100ml. Do pozostałego osadu dodałyśmy 25 ml świeżej mieszaniny eteru naftowego oraz dichlorometanu (w proporcji podanej wyżej). Następnie tak powstałą mieszaninę umieszczamy w łaźni ultradźwiękowej na 10 min, po tym czasie przesączyłyśmy ekstrakt przez ten sam sączek, którego używałyśmy w doświadczeniu. Połączone ekstrakty odparowałyśmy na odparowywaczu obrotowym w temperaturze ok. 23°C do objętości ok. 4ml. Po odparowaniu pozostawiłyśmy ekstrakt do analizy TLC (2.3.)

2. Ekstrakcja gleby w aparacie Soxhleta

Sucha glebę roztarłyśmy w moździerzu tak, by nie było żadnych grudek. 20g roztartej gleby przeniosłyśmy na gilzę, którą z kolei po złożeniu umieściłyśmy w nasadce ekstrakcyjnej aparatu Soxhleta. Następnie do kolby okrągłodennej wrzuciłyśmy kilka kamyków wrzennych oraz dodałyśmy 130ml eteru naftowego. Kolbę tę umieściłyśmy w płaszczu grzejnym, na nią zamontowałyśmy aparat Soxhleta wraz z nasza próbką, całość podłączyłyśmy do chłodnicy zwrotnej. Po włączeniu przepływu wody do chłodnicy oraz rozpoczęciu ogrzewania eter naftowy znajdujący się w kolbie zaczął lekko wrzeć. Wrzący roztwór parował, następnie skraplał się na chłodnicy wracając do kolby i przechodząc przez próbkę w aparacie. Czas ekstrakcji wyniósł 1 godzinę. Po tym czasie wyłączyłyśmy ogrzewanie, zaś zawartość kolby przeniosłyśmy do kolby o pojemności 250ml, którą następnie umieściłyśmy w odparowywaczu obrotowym w temperaturze 23°C do objętości ok. 4ml. Tak powstały ekstrakt pozostawiłyśmy do analizy TLC (2.3.)

3. Chromatografia cienkowarstwowa - Analiza TLC

Komorę chromatograficzną napełniłyśmy fazą ruchomą w postaci 3ml Cykloheksanu i toluenu w stosunku objętościowym 66:33, następnie pozostawiłyśmy całość na 10 minut. W tym czasie na płytkach TLC narysowałyśmy delikatnie linię startową (0,8cm od dolnego brzegu płytki) oraz linię końcową (1cm od górnego brzegu płytki). Na linii startowej zaznaczyłyśmy 4 punkty, które w dalszej części doświadczenia były miejscem nanoszenia próbek ekstraktów.

Analizę TLC wykonałyśmy dla dwóch uzyskanych wcześniej ekstraktów gleby oraz dla dwóch wzorców WWA. Na płytkę TLC naniosłyśmy każdy wzorzec i ekstrakt w podobnej objętości - ok. 3-5ml po 6 kropel.

Punkt 1. Wzorzec WWA 9,10-difenyloantracen

Punkt 2. Wzorzec WWA 2-metyloantracen

Punkt 3. Ekstrakt uzyskany przez ekstrakcję aparatem Soxhleta

Punkt 4. Ekstrakt uzyskany dzięki kąpielom ultradźwiękowym

Tak przygotowaną płytkę z naniesionymi substancjami umieściłyśmy w komorze chromatograficznej tak, by dół płytki dotykał rozpuszczalnika w środku. Następnie zamknęłyśmy komorę i poczekałyśmy, aż rozpuszczalnik dotrze do linii końcowej narysowanej na płytce TLC. Następnie wyjęłyśmy płytkę i osuszyłyśmy, po czym umieściłyśmy płytkę pod lampą UV i odrysowałyśmy widoczne plamki (Rysunek 1.)

Rysunek 1. Płytka TLC wraz z zaznaczonymi plamkami oraz miarą porównawczą

3. Opracowanie pomiarów

1. Wyznaczanie współczynnika opóźnienia Rf dla wzorca oraz substancji obecnych w ekstraktach.

Współczynnik opóźnienia definiowany jest jako stosunek drogi migracji substancji chromatografowanej od linii startu do środka plamki (B), do drogi przebytej przez czoło fazy ruchomej (A) (Rysunek 2.)

Rysunek 2. Schemat chromatografu TLC, źródło: http://wojciechzapala.sd.prz.edu.pl/

Wzór na współczynnik opóźnienia ma następującą postać:

A - odległość czoła rozpuszczalnika od linii startu (A=5,1cm)

B - odległość środka plamki danej substancji od linii startu

Zatem dla kolejnych plamek wyniki prezentują się następująco:

1) Punkt 1. Wzorzec WWA 9,10-difenyloantracen

A = 5,1cm

B = 4,1cm

Rf = 4,1/5,1 = 0,8039

2) Punkt 2. Wzorzec WWA 2-metyloantracen

A = 5,1cm

B = 4 cm

Rf = 4 /5,1 = 0,7843

3) Punkt 3. Ekstrakt uzyskany przez ekstrakcję aparatem Soxhleta

A = 5,1cm

B = 4 cm

Rf = 4 /5,1 = 0,7843

4) Punkt 4. Ekstrakt uzyskany dzięki kąpielom ultradźwiękowym

A = 5,1cm

B = 4,1 cm

Rf = 4,1/5,1 = 0,8039

4. Wnioski

Wyniki uzyskane w doświadczeniu pozwalają stwierdzić, że ekstrakcja wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych była bardzo skuteczna. W wyniku ekstrakcji gleby pochodzącej z okolic Wydziału Chemii Uniwersytetu Gdańskiego oraz porównania ekstraktów ze wzorcami możemy stwierdzić z całą pewnością, że gleba ta zawiera WWA. Wartość współczynnika Rf mieści się w przedziale 0-1, przy czym najbardziej wiarygodne są wyniki w przedziale Rf= (0,2-0,8) ponieważ świadczą o stabilności rozdziału chromatograficznego. Gdy Rf jest bliskie zeru wtedy mamy do czynienia z sytuacją, gdy rozdzielane substancje silnie oddziałują z fazą nieruchomą. Rf bliskie jedności oznacza, iż substancje wędrują z fazą ruchomą i maja minimalną adsorpcję.

Wartość Rf obliczona dla każdego wzorca stanowi podstawę do jego identyfikacji w mieszaninie. Podczas analizy nieznanej mieszaniny możemy na podstawie współczynnika opóźnienia dla ekstraktów oraz wzorców określić jej skład jakościowy, przy czym na wartość Rf analizowanej próby ma wpływ ogrom czynników takich jak:

• rodzaj i jakość adsorbentu - wielkość ziaren, jednorodność i grubość warstwy adsorbentu,

• rodzaj i skład eluentu,

• struktura i własności fizykochemiczne analizowanych substancji, ·

• temperatura,

• kształt i wielkość naniesionej na płytkę plamki - dokładność dozowania, ilość,

• warunki prowadzenia procesu - kształt oraz wielkość komory chromatograficznej, stopień wysycenia komory parami fazy ruchomej.

Wszystkie te czynniki mogą w znacznym stopniu przyczyniać się do powstawania odstępstw kształtów plam od idealnie symetrycznych. Powyższe czynniki wpływają na liniowość adsorpcji testowanej substancji.

Bober J., Chlubek D., Dołęgowska B., Przewodnik do zajęć z chemii medycznej dla studentów I roku PAM. Wydawnictwo Pomorskiej Akademii Medycznej; 2006;

Witkiewicz Z., Podstawy chromatografii, Wydawnictwo Naukowo-Techniczne, 2000, Warszawa, str. 219-257;

4

1 2 3 4

---