Laboratorium chemia 3, Przyroda UG, Laboratorium - chemia


Laboratorium Przyrodnicze: Chemia

Sprawozdanie z ćwiczeń z dnia 04.04.2014

Ćw. 4: OZNACZANIE ZAWARTOŚCI ZWIĄZKÓW FENOLOWYCH W MATERIALE ROŚLINNYM METODĄ SPEKTROFOTOMETRYCZNĄ

Przyroda II rok

04.04.2014

  1. Wstęp teoretyczny

    1. Zaburzenie równowagi procesów redukcyjno-oksydacyjnych

Zaburzenia te prowadzą do stresu oksydacyjnego, jest to stan braku równowagi pomiędzy działaniem reaktywnych form tlenu a biologiczną zdolnością do szybkiej detoksykacji reaktywnych produktów pośrednich lub naprawy wyrządzonych szkód. Wszystkie formy życia utrzymują w komórkach środowisko redukujące, które jest zachowywane przez aktywność enzymów podtrzymujących stan redukcji poprzez ciągły dopływ energii metabolicznej. Zaburzenia w prawidłowym stanie redukcji mogą wywołać toksyczne działanie poprzez produkcję nadtlenków i wolnych rodników, powodujących oksydacyjne uszkodzenia wszystkich składników komórki, a szczególnie dotkliwe dla komórki są uszkodzenia białek, lipidów i DNA.

    1. Czym są polifenole

Związki polifenolowe do których zaliczane się głównie flawonoidy, w tym antocyjanidyny, procyjanidyny i katechiny oraz fenolokwasy np. kwas elagowy, kawowy czy chlorogenowy, są szeroko rozpowszechnione w świecie roślin. Polifenole występują w dużych ilościach w produktach spożywczych stanowiących codzienną dietę człowieka. Najpopularniejszym źródłem polifenoli jest m.in. liść herbaty otrzymywany z krzewów herbacianych Camelia sinensis z rodziny Theaceae. Herbata pochodzi najprawdopodobniej z Chin i Indii. Obecnie uprawiana jest w kilku odmianach, takich jak: herbata zielona, czarna, czy herbata biała.

Korzystną właściwością polifenoli jest działanie antyoksydacyjne. Jako związki o działaniu przeciwutleniającym chronią wiązania łańcucha DNA przed rozszczepieniem powodowanym przez rodniki tlenowe. Ponadto zapobiegają przekształceniom związków chemicznych, które przedostały się do naszego organizmu, w pochodne kancerogenne. Przykładem mogą być mykotoksyny produkowane przez pleśnie obecne w żywności. I tak np. aflatoksyny (wytwarzane przez grzyby z gatunków Aspergillus flavus i Aspergillus parasiticus), aby stały się potencjalnie rakotwórcze wymagają aktywacji przy udziale enzymów oksydacyjnych takich jak monooksygenaza cyt.P-450 i NADPH-cytP-450.

W wyniku reakcji utleniania powstają związki o dużej mutagenności i kancerogenności np. epoksydy aflatoksyny, które zapoczątkowują kancerogenezę. Polifenole jako silne antyoksydanty mają zdolność zablokowania tego typu przemian.

Podczas reakcji ABT S z flawonoidami powstają produkty o silniejszych właściwościach antyoksydacyjnych i szybciej reagujące z rodnikiem niż związki macierzyste. Wartość TEA C jest w tej sytuacji sumą aktywności substancji badanej i produktów jej reakcji z rodnikiem. To może się stać powodem zafałszowania wyników analiz wskutek zawyżenia wartości właściwości antyoksydacyjnych.

Do oznaczania potencjału przeciwutleniającego używa się również metody z zastosowaniem odczynnika Folina-Ciocalteau (F-C). Metoda ta służy do analizy całkowitej zawartości fenoli. Oparta jest na barwnej reakcji między polifenolami, a odczynnikiem. Jej zaletą jest duża prostota i użyteczność do standaryzacji materiałów biologicznych, wadą zaś mała specyficzność. Odczynnik F-C jest przygotowywany przez zmieszanie wolframianu sodu (Na2WO 4), molibdenianu sodu (Na2MoO4), siarczanu litu (Li2SO4), wody bromowej oraz stężonych kwasów solnego i fosforowego. Nie określono dokładnej struktury związku powstającego w czasie przygotowania tego odczynnika. Przypuszczalnie jest to heteropolifosfowolframian molibdenu. Daje on, w wyniku odwracalnej reakcji jedno- lub dwuelektronowej redukcji, niebiesko zabarwiony związek (PMoW11O40)4-. Molibdenian

Mo(VI) przyjmuje elektron i redukowany jest do Mo(V). Związki fenolowe reagują z odczynnikiem F-C jedynie w środowisku alkalicznym (pH 10). Tylko w tych warunkach powstaje anion fenolowy, który redukuje odczynnik F-C. Mechanizm reakcji opiera się na przenoszeniu elektronu, a tworzenie niebieskiego barwnika w reakcji związków fenolowych z odczynnikiem F-C jest niezależne od struktury fenoli.

Powyższa metoda znajduje zastosowanie w analizie ekstraktów roślinnych, żywności, a także leków, których elementami są grupy fenolowe, jak np. salbutamol i morfina.

    1. Spektrofotometria

Spektrofotometria w zakresie nadfioletu (UV) i promieniowania widzialnego (Vis) jest jedną z najstarszych metod instrumentalnych w analizie chemicznej. Zjawisko pochłaniania energii promieniowania elektromagnetycznego przez materię (absorpcja) znalazło szerokie zastosowanie zarówno w badaniach struktury cząsteczek, jak też w jakościowej i ilościowej analizie chemicznej. Promieniowanie elektromagnetyczne można zdefiniować jako postać energii występującą w formie fal, czyli rozchodzących się z prędkością 3*105 km/s periodycznych zmian pola elektrycznego i magnetycznego.

  1. Przebieg doświadczeń

    1. Ekstrakcja skórek i nasion winogron czerwonych

20mg rozdrobnionych zliofilizowanych skórek i nasion czerwonych winogron umieściłyśmy w naczynku o pojemności 4ml. Do naczynka dodałyśmy 1ml 1% roztworu kwasu octowego w metanolu, zaś przestrzeń nad cieczą z pomocą Prowadzącego przedmuchałyśmy azotem. Po zamknięciu naczynka zawinęłyśmy je folią aluminiową i odstawiłyśmy do łaźni lodowo-wodnej, całość następnie umieściłyśmy w łaźni ultradźwiękowej na 6 min sprawdzając co jakiś czas czy nie należy uzupełnić lodu. Po ekstrahowaniu umieściłyśmy próbkę do dekantacji w ciemnym miejscu.

    1. Ekstrakcja czerwonej cebuli

Rozdrobniłyśmy czerwoną cebulę w moździerzu, następnie odważyłyśmy z całości 100mg

i umieściłyśmy je w naczynku 4ml. Następne kroki były identyczne jak w przypadku ekstrakcji skórek i nasion z czerwonych winogron z punktu 2.1..

    1. Przygotowanie odpowiednich rozcieńczeń roztworu kwasu galusowego

Uzyskanie odpowiednich stężeń oznaczało umieszczenie w naczynkach o pojemności 5ml odpowiednią objętość roztworu kwasu galusowego o stężeniu 5000mg/ml i dodaniu wody destylowanej do objętości 5ml.

Stężenia roztworów kalibracyjnych:

0 0,05mg/ml 0,15mg/ml 0,25mg/ml 0,35mg/ml 0,5mg/ml

W tym celu musiałyśmy posłużyć się równaniem proporcji:

c1v1 = c2v2

dla

c1 = 5000 μg/ml

c2 = (odpowiednie stężenie w mg/ml)*1000 μg/ml

v1 = x ml

v2 = 5 ml

Oznacza to, iż do wykonania roztworów o odpowiednich stężeniach musiałyśmy wykorzystać:

0ml 0,05ml 0,15ml 0,25ml 0,35ml 0,5ml kwasu galusowego.

Następnie z utworzonych roztworów kalibracyjnych pobrałyśmy po 20 μl do naczynek o pojemności 4ml, następnie dodałyśmy 1,58ml wody oraz po 100 μl odczynnika Folina-Ciocalteu'a. Tak przygotowane roztwory pozostawiłyśmy na 3 minuty, po czym dodałyśmy jeszcze po 300 μl nasyconego roztworu węglanu sodu. Umieściłyśmy zamknięte fiolki z roztworami na 30 minut w termostacie ustawionym na 40°C.

    1. Przygotowanie ekstraktów z cebuli i winogron do mierzenia absorbancji

Pobrałyśmy po 20 μl ekstraktów do naczynek o pojemności 4ml. Kolejne kroki wyglądały identycznie jak w przypadku przygotowania roztworów kalibracyjnych w akapicie 2 w punkcie 2.3. Po 30 minutach przeszłyśmy do spektrofotometru, dzięki któremu mierzyłyśmy absorbancję roztworów i ekstraktów. Wyniki badań podano w tabeli 1. (dla roztworu kalibracyjnego) oraz tabeli 2. (dla materiału roślinnego).

Tab.1

Pomiar absorbancji dla różnych stężeń roztworu kalibracyjnego

Stężenie

μg/ml

Długość fali λ [nm]

735

765

50

0,0867

0,0909

50

0,0842

0,0887

50

0,0832

0,0872

150

0,1842

0,1879

150

0,1830

0,1886

150

0,1823

0,1873

250

0,3048

0,3116

250

0,3031

0,3107

250

0,3034

0,3119

350

0,3488

0,3597

350

0,3473

0,3590

350

0,3477

0,3594

500

0,5381

0,5417

500

0,5268

0,5355

500

0,5263

0,5362

Tab.2

Pomiar absorbancji dla materiału roślinnego

Stężenie

μg/ml

Długość fali λ [nm]

735

765

Cebula

0,1717

0,1749

0,1772

0,1794

0,1697

0,1724

0,1730

0,1732

0,1672

0,1700

Winogrona

0,2766

0,2745

0,2788

0,2792

0,2723

0,2742

0,2750

0,2765

0,2754

0,2735

Wartości te pozwoliły nam na policzenie średnich wartości absorbancji oraz wyznaczenie krzywej kalibracyjnej (Załącznik 1. oraz 2.), a także średnią absorbancję dla cebuli czerwonej oraz czerwonych winogron.

Tab.3

Średnia absorbancja dla różnych stężeń roztworu kalibracyjnego

Stężenie

μg/ml

Długość fali λ [nm]

735

odchylenie

765

odchylenie

50

0,0847

0,0018

0,0889

0,0019

150

0,1832

0,0010

0,1879

0,0007

250

0,3038

0,0009

0,3114

0,0006

350

0,3479

0,0008

0,3594

0,0004

500

0,5304

0,0067

0,5378

0,0034

Tab.4

Średnia absorbancja dla materiału roślinnego

Materiał

Długość fali λ [nm]

735

odchylenie

765

odchylenie

Cebula

0,1718

0,0037

0,1740

0,0035

Winogrono

0,2756

0,0024

0,2756

0,0023

  1. Opracowanie pomiarów

    1. Wykreślenie krzywej kalibracyjnej ( załącznik 1. i 2.)

    1. Obliczenie zawartości polifenoli w związkach roślinnych dla długości fali λ =735nm


c=132,5μg/ml

c=0,1325mg/ml

0,1325mg -- 20μg

x mg -- 1000μl

x=6,625mg

6,625mg - 100mg

y mg - 1000mg

y=66,25mg/g

c=236,3μg/ml

c=0,2363mg/ml

0,2363mg -- 20μg

x mg -- 1000μl

x=11,815mg

11,815mg - 100mg

y mg - 1000mg

y=118,15mg/g


    1. Obliczenie zawartości polifenoli w związkach roślinnych dla długości fali λ =765nm


c=130,4μg/ml

c=0,1304mg/ml

0,1304mg -- 20μg

x mg -- 1000μl

x=6,525mg

6,52mg - 100mg

y mg - 1000mg

y=65,2mg/g

c=232μg/ml

c=0,232mg/ml

0,232mg -- 20μg

x mg -- 1000μl

x=11,6mg

11,6mg - 100mg

y mg - 1000mg

y=116mg/g


  1. Wnioski

Tabela podsumowująca zawartość polifenoli w cebuli i winogronie została przedstawiona poniżej.

Tab.5

Zawartość polifenoli [mg/g]

Długość fali λ [nm]

735

765

Cebula

66,25

65,2

Winogrono

118,15

116

Porównując zawarte w tabeli informacje można stwierdzić, że czerwone winogrona zawierają niemal dwukrotnie więcej polifenoli na 1g niż czerwona cebula. Norma zawartości polifenoli w winogronach wynosi ok.80 mg/g, a w cebuli ok.70 mg/g. Zawartość polifenoli uzyskana w doświadczeniu w przypadku winogron jest powyżej normy, zaś w cebuli mieści się ona się w normie. Mimo to zarówno winogrona, jak i cebule są bardzo istotnymi elementami diety uzupełniającymi ją w składniki antyoksydacyjne.

Owoce i warzywa są niezwykle istotnymi produktami w diecie człowieka, ponieważ zawierają one wiele cennych witamin i składników mineralnych, dodatkowo są źródłem innych cennych substancji o podobnym charakterze jak witaminy. Do tych substancji należą związki polifenolowe, które najszerzej są reprezentowane przez flawonoidy. Związki te występują w różnych ilościach w owocach i warzywach i każda z grup jest charakterystyczna dla innych grup owoców i warzyw, przy czym najwięcej polifenoli zawierają surowe warzywa i owoce.

Wyniki wielu badań wskazują, że związki polifenolowe z owoców i warzyw mają istotne znaczenie w profilaktyce wielu schorzeń. Związane jest to z silnymi właściwościami antyoksydacyjnymi tych związków, umożliwiają nam one efektywną ochronę przed stresem oksydacyjnym i pozwalają zmniejszyć ryzyko wystąpienia schorzeń krążenia czy też chorób nowotworowych. Należy uzupełniać swoją dietę o surowe warzywa i owoce bogate w związki polifenolowe.

Zhang Q, Zhang J, Shen J, Silva A, Dennis DA, Barrow CJ. A simple 96-well microplate method for

estimation of total polyphenol content in seaweeds. J Appl Physiol 2006; 18:445-50.

Y u Z, Dahlgren RA. Evaluation of methods for measuring polyphenols in conifer foliage. Analyst 2000; 26:98-113.

Grajek W., Przeciwutleniacze w żywności, Warszawa, 2007.

Sadler NP, Jacobs H. Application of the Folin-Ciocalteau reagent to the determination of salbutamol in pharmaceutical preparations. Talanta 1995, 42:1385-8.

Gheribi E., Związki polifenolowe w owocach i warzywach [w:] Borgis Medycyna Rodzinna, nr 4, 2011, str.111-115

Czeczot H., Majewska M., Flawonoidy w profilaktyce i terapii [w:] Terapia i leki, tom 65, nr 5, 2009, str 369-377

2



Wyszukiwarka

Podobne podstrony:
Laboratorium chemia 4, Przyroda UG, Laboratorium - chemia
Laboratorium chemia 1 ver2, Przyroda UG, Laboratorium - chemia
Laboratorium chemia 1 ver1, Przyroda UG, Laboratorium - chemia
Laboratorium chemia 2, Przyroda UG, Laboratorium - chemia
Laboratorium Fizyki Współczesnej II gauss, Przyroda UG, Laboratorium fizyka współczesna II
Laboratorium Fizyki Współczesnej II pochl, Przyroda UG, Laboratorium fizyka współczesna II
Laboratorium Fizyka Współczesna I dyfr el, Przyroda UG, Laboratorium fizyka współczesna I
Laboratorium Fizyka Współczesna I pociag, Przyroda UG, Laboratorium fizyka współczesna I
Laboratorium Fizyka Współczesna I monochromator, Przyroda UG, Laboratorium fizyka współczesna I
Laboratorium Fizyki Współczesnej II bezwglwzgl, Przyroda UG, Laboratorium fizyka współczesna II
Laboratorium Fizyka Współczesna I interferencja, Przyroda UG, Laboratorium fizyka współczesna I
Laboratorium Fizyki Współczesnej II aktywacja, Przyroda UG, Laboratorium fizyka współczesna II
Laboratorium Fizyka Współczesna I fotokomorka, Przyroda UG, Laboratorium fizyka współczesna I
Laboratorium Fizyka Współczesna II ferr, Przyroda UG, Laboratorium fizyka współczesna II
Oceanografia3, Przyroda UG, Oceanografia
Oceanografia2, Przyroda UG, Oceanografia
Oceanografia1, Przyroda UG, Oceanografia
Oceanografia5, Przyroda UG, Oceanografia
Oceanografia4, Przyroda UG, Oceanografia

więcej podobnych podstron