Laboratorium Przyrodnicze: Chemia
Sprawozdanie z ćwiczeń z dnia 04.04.2014
Ćw. 4: OZNACZANIE ZAWARTOŚCI ZWIĄZKÓW FENOLOWYCH W MATERIALE ROŚLINNYM METODĄ SPEKTROFOTOMETRYCZNĄ
Przyroda II rok
04.04.2014
Wstęp teoretyczny
Zaburzenie równowagi procesów redukcyjno-oksydacyjnych
Zaburzenia te prowadzą do stresu oksydacyjnego, jest to stan braku równowagi pomiędzy działaniem reaktywnych form tlenu a biologiczną zdolnością do szybkiej detoksykacji reaktywnych produktów pośrednich lub naprawy wyrządzonych szkód. Wszystkie formy życia utrzymują w komórkach środowisko redukujące, które jest zachowywane przez aktywność enzymów podtrzymujących stan redukcji poprzez ciągły dopływ energii metabolicznej. Zaburzenia w prawidłowym stanie redukcji mogą wywołać toksyczne działanie poprzez produkcję nadtlenków i wolnych rodników, powodujących oksydacyjne uszkodzenia wszystkich składników komórki, a szczególnie dotkliwe dla komórki są uszkodzenia białek, lipidów i DNA.
Czym są polifenole
Związki polifenolowe do których zaliczane się głównie flawonoidy, w tym antocyjanidyny, procyjanidyny i katechiny oraz fenolokwasy np. kwas elagowy, kawowy czy chlorogenowy, są szeroko rozpowszechnione w świecie roślin. Polifenole występują w dużych ilościach w produktach spożywczych stanowiących codzienną dietę człowieka. Najpopularniejszym źródłem polifenoli jest m.in. liść herbaty otrzymywany z krzewów herbacianych Camelia sinensis z rodziny Theaceae. Herbata pochodzi najprawdopodobniej z Chin i Indii. Obecnie uprawiana jest w kilku odmianach, takich jak: herbata zielona, czarna, czy herbata biała.
Korzystną właściwością polifenoli jest działanie antyoksydacyjne. Jako związki o działaniu przeciwutleniającym chronią wiązania łańcucha DNA przed rozszczepieniem powodowanym przez rodniki tlenowe. Ponadto zapobiegają przekształceniom związków chemicznych, które przedostały się do naszego organizmu, w pochodne kancerogenne. Przykładem mogą być mykotoksyny produkowane przez pleśnie obecne w żywności. I tak np. aflatoksyny (wytwarzane przez grzyby z gatunków Aspergillus flavus i Aspergillus parasiticus), aby stały się potencjalnie rakotwórcze wymagają aktywacji przy udziale enzymów oksydacyjnych takich jak monooksygenaza cyt.P-450 i NADPH-cytP-450.
W wyniku reakcji utleniania powstają związki o dużej mutagenności i kancerogenności np. epoksydy aflatoksyny, które zapoczątkowują kancerogenezę. Polifenole jako silne antyoksydanty mają zdolność zablokowania tego typu przemian.
Podczas reakcji ABT S z flawonoidami powstają produkty o silniejszych właściwościach antyoksydacyjnych i szybciej reagujące z rodnikiem niż związki macierzyste. Wartość TEA C jest w tej sytuacji sumą aktywności substancji badanej i produktów jej reakcji z rodnikiem. To może się stać powodem zafałszowania wyników analiz wskutek zawyżenia wartości właściwości antyoksydacyjnych.
Do oznaczania potencjału przeciwutleniającego używa się również metody z zastosowaniem odczynnika Folina-Ciocalteau (F-C). Metoda ta służy do analizy całkowitej zawartości fenoli. Oparta jest na barwnej reakcji między polifenolami, a odczynnikiem. Jej zaletą jest duża prostota i użyteczność do standaryzacji materiałów biologicznych, wadą zaś mała specyficzność. Odczynnik F-C jest przygotowywany przez zmieszanie wolframianu sodu (Na2WO 4), molibdenianu sodu (Na2MoO4), siarczanu litu (Li2SO4), wody bromowej oraz stężonych kwasów solnego i fosforowego. Nie określono dokładnej struktury związku powstającego w czasie przygotowania tego odczynnika. Przypuszczalnie jest to heteropolifosfowolframian molibdenu. Daje on, w wyniku odwracalnej reakcji jedno- lub dwuelektronowej redukcji, niebiesko zabarwiony związek (PMoW11O40)4-. Molibdenian
Mo(VI) przyjmuje elektron i redukowany jest do Mo(V). Związki fenolowe reagują z odczynnikiem F-C jedynie w środowisku alkalicznym (pH 10). Tylko w tych warunkach powstaje anion fenolowy, który redukuje odczynnik F-C. Mechanizm reakcji opiera się na przenoszeniu elektronu, a tworzenie niebieskiego barwnika w reakcji związków fenolowych z odczynnikiem F-C jest niezależne od struktury fenoli.
Powyższa metoda znajduje zastosowanie w analizie ekstraktów roślinnych, żywności, a także leków, których elementami są grupy fenolowe, jak np. salbutamol i morfina.
Spektrofotometria
Spektrofotometria w zakresie nadfioletu (UV) i promieniowania widzialnego (Vis) jest jedną z najstarszych metod instrumentalnych w analizie chemicznej. Zjawisko pochłaniania energii promieniowania elektromagnetycznego przez materię (absorpcja) znalazło szerokie zastosowanie zarówno w badaniach struktury cząsteczek, jak też w jakościowej i ilościowej analizie chemicznej. Promieniowanie elektromagnetyczne można zdefiniować jako postać energii występującą w formie fal, czyli rozchodzących się z prędkością 3*105 km/s periodycznych zmian pola elektrycznego i magnetycznego.
Przebieg doświadczeń
Ekstrakcja skórek i nasion winogron czerwonych
20mg rozdrobnionych zliofilizowanych skórek i nasion czerwonych winogron umieściłyśmy w naczynku o pojemności 4ml. Do naczynka dodałyśmy 1ml 1% roztworu kwasu octowego w metanolu, zaś przestrzeń nad cieczą z pomocą Prowadzącego przedmuchałyśmy azotem. Po zamknięciu naczynka zawinęłyśmy je folią aluminiową i odstawiłyśmy do łaźni lodowo-wodnej, całość następnie umieściłyśmy w łaźni ultradźwiękowej na 6 min sprawdzając co jakiś czas czy nie należy uzupełnić lodu. Po ekstrahowaniu umieściłyśmy próbkę do dekantacji w ciemnym miejscu.
Ekstrakcja czerwonej cebuli
Rozdrobniłyśmy czerwoną cebulę w moździerzu, następnie odważyłyśmy z całości 100mg
i umieściłyśmy je w naczynku 4ml. Następne kroki były identyczne jak w przypadku ekstrakcji skórek i nasion z czerwonych winogron z punktu 2.1..
Przygotowanie odpowiednich rozcieńczeń roztworu kwasu galusowego
Uzyskanie odpowiednich stężeń oznaczało umieszczenie w naczynkach o pojemności 5ml odpowiednią objętość roztworu kwasu galusowego o stężeniu 5000mg/ml i dodaniu wody destylowanej do objętości 5ml.
Stężenia roztworów kalibracyjnych:
0 0,05mg/ml 0,15mg/ml 0,25mg/ml 0,35mg/ml 0,5mg/ml
W tym celu musiałyśmy posłużyć się równaniem proporcji:
c1v1 = c2v2
dla
c1 = 5000 μg/ml
c2 = (odpowiednie stężenie w mg/ml)*1000 μg/ml
v1 = x ml
v2 = 5 ml
Oznacza to, iż do wykonania roztworów o odpowiednich stężeniach musiałyśmy wykorzystać:
0ml 0,05ml 0,15ml 0,25ml 0,35ml 0,5ml kwasu galusowego.
Następnie z utworzonych roztworów kalibracyjnych pobrałyśmy po 20 μl do naczynek o pojemności 4ml, następnie dodałyśmy 1,58ml wody oraz po 100 μl odczynnika Folina-Ciocalteu'a. Tak przygotowane roztwory pozostawiłyśmy na 3 minuty, po czym dodałyśmy jeszcze po 300 μl nasyconego roztworu węglanu sodu. Umieściłyśmy zamknięte fiolki z roztworami na 30 minut w termostacie ustawionym na 40°C.
Przygotowanie ekstraktów z cebuli i winogron do mierzenia absorbancji
Pobrałyśmy po 20 μl ekstraktów do naczynek o pojemności 4ml. Kolejne kroki wyglądały identycznie jak w przypadku przygotowania roztworów kalibracyjnych w akapicie 2 w punkcie 2.3. Po 30 minutach przeszłyśmy do spektrofotometru, dzięki któremu mierzyłyśmy absorbancję roztworów i ekstraktów. Wyniki badań podano w tabeli 1. (dla roztworu kalibracyjnego) oraz tabeli 2. (dla materiału roślinnego).
Tab.1
Pomiar absorbancji dla różnych stężeń roztworu kalibracyjnego |
||
Stężenie μg/ml |
Długość fali λ [nm] |
|
|
735 |
765 |
50 |
0,0867 |
0,0909 |
50 |
0,0842 |
0,0887 |
50 |
0,0832 |
0,0872 |
150 |
0,1842 |
0,1879 |
150 |
0,1830 |
0,1886 |
150 |
0,1823 |
0,1873 |
250 |
0,3048 |
0,3116 |
250 |
0,3031 |
0,3107 |
250 |
0,3034 |
0,3119 |
350 |
0,3488 |
0,3597 |
350 |
0,3473 |
0,3590 |
350 |
0,3477 |
0,3594 |
500 |
0,5381 |
0,5417 |
500 |
0,5268 |
0,5355 |
500 |
0,5263 |
0,5362 |
Tab.2
Pomiar absorbancji dla materiału roślinnego |
||
Stężenie μg/ml |
Długość fali λ [nm] |
|
|
735 |
765 |
Cebula |
0,1717 |
0,1749 |
|
0,1772 |
0,1794 |
|
0,1697 |
0,1724 |
|
0,1730 |
0,1732 |
|
0,1672 |
0,1700 |
Winogrona |
0,2766 |
0,2745 |
|
0,2788 |
0,2792 |
|
0,2723 |
0,2742 |
|
0,2750 |
0,2765 |
|
0,2754 |
0,2735 |
Wartości te pozwoliły nam na policzenie średnich wartości absorbancji oraz wyznaczenie krzywej kalibracyjnej (Załącznik 1. oraz 2.), a także średnią absorbancję dla cebuli czerwonej oraz czerwonych winogron.
Tab.3
Średnia absorbancja dla różnych stężeń roztworu kalibracyjnego |
||||
Stężenie μg/ml |
Długość fali λ [nm] |
|||
|
735 |
odchylenie |
765 |
odchylenie |
50 |
0,0847 |
0,0018 |
0,0889 |
0,0019 |
150 |
0,1832 |
0,0010 |
0,1879 |
0,0007 |
250 |
0,3038 |
0,0009 |
0,3114 |
0,0006 |
350 |
0,3479 |
0,0008 |
0,3594 |
0,0004 |
500 |
0,5304 |
0,0067 |
0,5378 |
0,0034 |
Tab.4
Średnia absorbancja dla materiału roślinnego |
||||
Materiał |
Długość fali λ [nm] |
|||
|
735 |
odchylenie |
765 |
odchylenie |
Cebula |
0,1718 |
0,0037 |
0,1740 |
0,0035 |
Winogrono |
0,2756 |
0,0024 |
0,2756 |
0,0023 |
Opracowanie pomiarów
Wykreślenie krzywej kalibracyjnej ( załącznik 1. i 2.)
Obliczenie zawartości polifenoli w związkach roślinnych dla długości fali λ =735nm
CEBULA
c=132,5μg/ml
c=0,1325mg/ml
0,1325mg -- 20μg
x mg -- 1000μl
x=6,625mg
6,625mg - 100mg
y mg - 1000mg
y=66,25mg/g
WINOGRONO
c=236,3μg/ml
c=0,2363mg/ml
0,2363mg -- 20μg
x mg -- 1000μl
x=11,815mg
11,815mg - 100mg
y mg - 1000mg
y=118,15mg/g
Obliczenie zawartości polifenoli w związkach roślinnych dla długości fali λ =765nm
CEBULA
c=130,4μg/ml
c=0,1304mg/ml
0,1304mg -- 20μg
x mg -- 1000μl
x=6,525mg
6,52mg - 100mg
y mg - 1000mg
y=65,2mg/g
WINOGRONO
c=232μg/ml
c=0,232mg/ml
0,232mg -- 20μg
x mg -- 1000μl
x=11,6mg
11,6mg - 100mg
y mg - 1000mg
y=116mg/g
Wnioski
Tabela podsumowująca zawartość polifenoli w cebuli i winogronie została przedstawiona poniżej.
Tab.5
Zawartość polifenoli [mg/g] |
||
Długość fali λ [nm] |
735 |
765 |
Cebula |
66,25 |
65,2 |
Winogrono |
118,15 |
116 |
Porównując zawarte w tabeli informacje można stwierdzić, że czerwone winogrona zawierają niemal dwukrotnie więcej polifenoli na 1g niż czerwona cebula. Norma zawartości polifenoli w winogronach wynosi ok.80 mg/g, a w cebuli ok.70 mg/g. Zawartość polifenoli uzyskana w doświadczeniu w przypadku winogron jest powyżej normy, zaś w cebuli mieści się ona się w normie. Mimo to zarówno winogrona, jak i cebule są bardzo istotnymi elementami diety uzupełniającymi ją w składniki antyoksydacyjne.
Owoce i warzywa są niezwykle istotnymi produktami w diecie człowieka, ponieważ zawierają one wiele cennych witamin i składników mineralnych, dodatkowo są źródłem innych cennych substancji o podobnym charakterze jak witaminy. Do tych substancji należą związki polifenolowe, które najszerzej są reprezentowane przez flawonoidy. Związki te występują w różnych ilościach w owocach i warzywach i każda z grup jest charakterystyczna dla innych grup owoców i warzyw, przy czym najwięcej polifenoli zawierają surowe warzywa i owoce.
Wyniki wielu badań wskazują, że związki polifenolowe z owoców i warzyw mają istotne znaczenie w profilaktyce wielu schorzeń. Związane jest to z silnymi właściwościami antyoksydacyjnymi tych związków, umożliwiają nam one efektywną ochronę przed stresem oksydacyjnym i pozwalają zmniejszyć ryzyko wystąpienia schorzeń krążenia czy też chorób nowotworowych. Należy uzupełniać swoją dietę o surowe warzywa i owoce bogate w związki polifenolowe.
Zhang Q, Zhang J, Shen J, Silva A, Dennis DA, Barrow CJ. A simple 96-well microplate method for
estimation of total polyphenol content in seaweeds. J Appl Physiol 2006; 18:445-50.
Y u Z, Dahlgren RA. Evaluation of methods for measuring polyphenols in conifer foliage. Analyst 2000; 26:98-113.
Grajek W., Przeciwutleniacze w żywności, Warszawa, 2007.
Sadler NP, Jacobs H. Application of the Folin-Ciocalteau reagent to the determination of salbutamol in pharmaceutical preparations. Talanta 1995, 42:1385-8.
Gheribi E., Związki polifenolowe w owocach i warzywach [w:] Borgis Medycyna Rodzinna, nr 4, 2011, str.111-115
Czeczot H., Majewska M., Flawonoidy w profilaktyce i terapii [w:] Terapia i leki, tom 65, nr 5, 2009, str 369-377
2