Ćwiczenia - 26.03.07 r.

FLUORESCENCJA

Jest to zjawisko emisji światła przez substancję w wyniku wzbudzenia światłem o krótszej długości fali.

Stan wzbudzenia fluorochromu jest bardzo nietrwały.

I etap - utrata energii w postaci ciepła.

II etap - powrót ze stanu wzbudzonego do stanu podstawowego i związana z tym emisja światła.

Mikroskop fluorescencyjny - mikr. wyposażony w dodatkowe układy optyczne oraz źródło światła o odpowiednim zakresie widma i energii promieniowania.

Źródła promieniowania:

- wysokociśnieniowe lampy rtęciowe - dają promieniowanie intensywne, ale nierównomierne; może wybuchnąć

- lampy halogenowe - promieniowanie równomierne, ale o niskiej intensywności

- źródła laserowe - promieniowanie o wysokiej energii, jednorodne

Drogi promieniowania

- kondensor - umożliwia wysoki kontrast fluorescencji na ciemnym tle

DIA

EPI

- zwierciadło pełni rolę filtra

- światło odbija się od preparatu (wędrówka światłą odbitego)

- rolę kondensora pełni obiektyw

Filtry

1. Zestaw pierwszy (filtry pierwotne, ekscytacyjne) - filtruje światło przed dotarciem do preparatu; przepuszcza tylko długości fal pobudzające odpowiedni znacznik fluorescencyjny.

2. Zestaw drugi (filtry wtórne, zaporowe) - z zatrzymanego uprzednio światła przepuszcza tylko długości fal emitowane przez znacznik fluorescencyjny.

Rodzaje:

- wiązki wąskiej - filtry szklane

- wiązki szerokiej - filtry interferencyjne, wykonywane w próżni i powleczone dielektrykami

Im węższa wiązka, tym bardziej może ona odpowiadać falom emitowanym przez fluorochrom. Jeżeli chce się analizować 2 kolory, można obserwować jeden po drugim, odpowiednio dobierając filtry i nakładając zdjęcia na siebie.

Fluorochromy

- substancje chemiczne wykazujące zdolność do absorpcji światła o pewnej długości fali oraz do emisji światła o innej, dłuższej fali.

Dzięki specyficznemu wiązaniu różnych cząstek umożliwiają badanie lokalizacji poszczególnych elementów komórek przy pomocy mikroskopu fuorescencyjnego.

- muszą być przechowywane w zaciemnieniu

- większość fluorochromów to substancje toksyczne

Przeciwciała (immunoglobuliny)

- monoklonalne - na początku tworzy się hybrydę komórek - produkującą swoiste przeicwciała z kom. nowotworową, która może dzielić się nieskończoną ilość razy. Te przeciwciała zawsze będą skierowane przeciw danemu epitopowi antygenu lub zestawowi epitopów.

- poliklonalne - uzyskiwane z krwi zwierząt, którym kilka tygodni wcześniej podano antygen; wykorzyst. w formie surowicy odpornościowej albo frakcji immunoglobulin G.

Przeciwciała są produkowane przez różne populacje komórek, dlatego ich reakcje mogą się różnić.

Rodzaje reakcji IMF.

- bezpośrednia - przeciwciało swoiste, sprzężone z fluorochromem

- pośrednia

- reakcja dwubarwna, trójbarwna - umożliwiają obserwacje więcej niż jednego antygenu w jednym skrawku lub jednej komórce, np. przeciwciała sprzężone z FIT C i TRIT C.

Antygeny można dodawać albo w postaci mieszaniny, albo sekwencyjnie, jeden po drugim.

Mikroskop konfokalny

Źródłem światła jest laser, którego cienki promień skanuje pole po polu obserwowane pole widzenia. Można przeanalizować intensywność fluorescencji na całej grubości skrawka.

Autofluorescencja - zdolność niektórych organizmów oraz elementów tkanek i komórek do emisji światła po wzbudzeniu promieniowaniem.

Autofluorescencję wykazują organizmy mające takie barwniki jak chlorofil, fikoerytryna, fikocyjanina, allofikocyjanina czy białko zielonej fluorescencji GFP.

---