Mikrobiologia - prezentacja I 31.05.2010r

Temat : Diagnostyka serologiczna - odczyny serologiczne w diagnostyce mikrobiologicznej.

1. Antygen - substancja,która łączy się z przeciwciałem poprzez swoiste miejsce wiążące; reakcja ta jest widoczna gołym okiem, może być wykorzystywana do wykrywania nieznanych antygenów w płynach, tkankach lub hodowlach

2. Przeciwciało - immunoglobulina wytwarzana pod wpływem działania antygenu, mająca zdolność wiązania się z nim.

3. Autoprzeciwciała - przeciwciała skierowane przeciwko własnym antygenom

4. Paratop - fragment wiążący determinantę antygenową

Metody serologiczne:

5. Precypitacja :

• przeciwciała biorące udział to precypity

• antygeny polisacharydowe i białka nie nadają się do reakcji precypitacji

• najprostszy typ reakcji wiązania się antygenu z przeciwciałem

• antygeny biorące udział to antygeny białkowe rozpuszczalne w wodzie, oznaczają się wielowartościowością

4. Przebieg reakcji:

• I etap : łączenie się antygenu ze swoistym przeciwciałem - powstaje hydrofobowy kompleks antygen-przeciwciało

• II etap : utworzony kompleks antygen- przeciwciało pod wpływem elektrolitu występującego w środowisku reakcji zostaje wytrącony w postaci strątu jako zmętnienie środowiska. Utworzony strąt nosi nazwę precypitatu

5. Zastosowanie reakcji precypitacji:

• wykrywanie obecności danego antygenu w badanym materiale

• obecność swoistych przeciwciał

6. Odczyny precypitacji w środowisku płynnym :

• odczyn precypitacji pierścieniowej - w mikrobiologii do klasyfikacji bakterii, do wykrywania obecności antygenów bakteryjnych w ekstraktach z tkanek

• odczyn flokulacyjny(test kłaczkujący VDRL) w diagnostyce kiły

• odczyn precypitacji szkiełkowej w bakteriologii do szybkiej identyfikacji danego szczepu bakteryjnego

7. Odczyn flokulacyjny (test kłaczkowy VDRL) - przykład reakcji precypitacji

8. Immunodyfuzja : ( w środowisku stałym)

• wywodzi się z reakcji precypitacji

• prowadzi się ją w podłożu żelowym

• odróżnia się tym, że pozwala badać równocześnie wiele układów antygen-przeciwciało

• odczyny te są oparte na zjawisku dyfuzji rozpuszczalnego antygenu i przeciwciała w żelu

9. Rodzaje :

• immunodyfuzja pojedyncza : jeden reagent dyfunduje, a drugi znajduje się w podłożu i jego stężenie jest stałe we wszystkich punktach

• immunodyfuzja podwójna: jeżeli oba reagenty - i antygen i przeciwciało dyfunduje w żelu

• w probówkach (Ouidina), na płytkach (Outcherlony'ego)

10. Podwójna dyfuzja (wg Outcherlony'ego)

a) Identyczność : przeciwciała precypitują identycznie...

11. Zastosowanie :

• identyfikacja antygenów, przeciwciał

• określenie ilościowe stężenia antygenów i przeciwciał

• określenie stopnia pokrewieństwa immunologicznego antygenów

12. Immunoelektroforeza - połączenie elektroforezy w żelu oraz podwójnej immunodyfuzji

a) rozdzielenie białek surowicy elektroforetycznie

b) w żelu agarowym robi się rowek, do rowka dodaje się przeciwciała, które dyfundują w żelu

13. Rodzaje :

• immunoelektroforeza wg Scheideggera

• immunoelektroforeza rakietkowa wg metody Laurella

• elektroimmunodyfuzja (immunoelektroforeza przeciwprądowa) - w diagnostyce chorób zakaźnych

• immunoelektroforeza krzyżowa

• Western blotting

14. Elektroforeza przeciwprądowa i rakietkowa.

15. Aglutynacyja :

• reakcja w której dochodzi do zlepiania się elementów upostaciowionych pod wpływem swoistych przeciwciał skierowanych...

• przeciwciała biorące udział to aglutyniny

16. Przebieg reakcji :

• I etap : wiązanie aglutynogenu z aglutyniną

• II etap : w obecności elektrolitów . . . . . . . kompleksów w postaci dobrze widocznych agregatów

17. Rodzaje :

• bezpośrednia (czynna) : przeciwciała reagują bezpośrednio z antygenami naturalnie występującymi na powierzchni komórki

• pośrednia (bierna) : przeciwciała reagują z antygenem rozpuszczalnym uprzednio opłaszczonym na nośniku

18. Aglutynacja bezpośrednia :

• odczyn Widala - diagnostyka duru brzusznego

• odczyn Weil - Felixa - diagnostyka duru plamistego

• odczyn Wrighta - diagnostyka brucelozy

19. Typy aglutynacji bakterii :

• Aglutynacja H (rzęskowa, obłoczkowa) występuje u bakterii posiadających antygen rzęskowy H. W obecności swoistych przeciwciał bakterie zlepiają się rzęskami, tworzy się delikatny strąt łatwo ulegający rozbiciu przy wstrząśnięciu

• Aglutynacja 0 (komórkowa, grudkowa) związana jest z obecnością antygenu somatycznego 0. Pod wpływem swoistych przeciwciał bakterie zlepiają się biegunami tworząc siatkę. Powstające aglutynaty tworzą zwarte grudki opadające na dno probówki.

• Aglutynacja Vi związana jest z obecnością antygenu powierzchniowego V. W obecności swoistych przeciwciał bakterie przylegają do siebie całą powierzchnią. Powstają drobne aglutynaty osadzające się na ściankach probówki.

(tutaj był rysunek tych trzech typów aglutynacji: somatic/flagella/virulence)

20. Aglutynacja pośrednia (bierna) :

• odczyn lateksowy

• odczyn hemaglutynacji

• odczyn hamowania hemaglutynacji

• odczyn antyglobulinowy (Coombsa)

21. OWD (odczyn wiązania dopełniacza) - jak wykonujemy,kiedy wynik + a kiedy - (poczytać)

22. Zastosowanie :

• bakteryjnych - kiła, bruceloza, tularemia, listerioza, twardziel, ornitozy, ozena

• wirusowych - grypa, nagminne zapalenie przyusznic, cytomegalia, poliomyelitis, limfocytarne zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych, kleszczowe zapalenie mózgu

• grzybiczych - kandidoza, aspergiloza

• chorób pasożytniczych - toksoplazmoza, pneumocytoza

23. ASO -przeczytać

Metody immunologiczne - zastosowanie znaczników

24. Rodzaje metod :

• metody fluorometryczne (FIA) : znacznikiem są fluorochromy

• metody radioimmunologiczne (RIA) : znacznikiem są pierwiastki promieniotwórcze

• metody immunoelektrymetryczne

• metody chemiluminescencyjne: znacznikami są określone subst. organiczne

25. Metody immunoenzymatyczne :

• test ELISA :

- do ilościowej oceny antygenu lub przeciwciała w badanym materiale

- powszechnie do wykrywania obecności . . .. i pasożytniczych do ilościowej oceny stężenia wielu hormonów, do wykrywania obecności antygenu

27. Przebieg reakcji :

28. Immunoblot :

• antygeny rozdzielone w trakcje elektroforezy agarozowej lub poliakrylamidowej są przeniesione na nitrocelulozę

• paski nitrocelulozy inkubuje się z surowicą badaną w środowisku buforu

• po wypłukaniu niezwiązanych przeciwciał dodaje się anty-ludzkich przeciwciał znakowanych peroksydazą

29. IGRA - IFN Gamma Release Assay

• grupa testów oparta na szczególnych właściwościach limfocytów T - uwalnianie interferonu gamma pod wpływem stymulacji...

• wykorzystywane między innymi w diagnostyce gruźlicy (Quantiferon Tb-Gold)

30. Quantiferon TB Gold - in tube

• oznaczenie polega na pobraniu krwi od pacjenta do dwóch probówek (testowa i kontrolna)

• probówka testowa zawiera mitogen i antygeny peptydowe Mycobacterium tuberculosis

• probówka kontrolna zawiera miogen

• inkubacja w temperaturze 37C przez 24godz celem proliferacji limfocytów T

• oznaczanie stężenia IFN - gamma metodą ELISA

---