ĆWICZENIE VIII

Temat : Udział drobnoustrojów w obiegu węgla w przyrodzie

Fermentacja mlekowa stanowi formę oddychania beztlenowego. Fermentacja mlekowa jest to mikrobiologiczny beztlenowy proces przekształcania węglowodorów do kwasu mlekowego. W procesie tym bakterie właściwej fermentacji mlekowej zdobywają energię. Należą do nich ziarniaki z rodziny Streptococcaceae (rodzaje Streptococcus, Leuconostoc i in.) i pałeczki z rodzaju Lactobacillus. Wszystkie te bakterie są gramdodatnie i na ogół nieruchliwe. Fizjologicznie są beztlenowcami względnymi. Oznaczają się złożonymi wymaganiami pokarmowymi (auksotrofy). Proces fermentacji może przebiegać w różny sposób.

• homofermentacja produkująca prawie wyłącznie (ponad 95%) kwas mlekowy i przebiegająca wg wzoru sumarycznego:

Rodzaje: Streptococcus, Streptobacterium, Thermobacterium

• heterofermentacja, w której wyniku powstaje ok. 50% kwasu mlekowego i znaczna ilość CO₂, kwasu octowego i (lub) etanolu. Sposób przebiegu tego typu fermentacji jest cechą gatunkową.

Rodzaje: Betacoccus, Betabacterium

• rzekoma fermentacja mlekowa (fermentacja pseudomlekowa) - kwas mlekowy może powstawać jako jeden z produktów metabolizmu niektórych bakterii z rodziny Enterobacteriaceae np. E. coli lub grzybów z klasy Zygomycetes np. Mucor, Rhizopus. Rozwój tych drobnoustrojów w kiszonkach roślinnych jest nie pożądany. 

Bakterie właściwej fermentacji mlekowej bytują na materiale roślinnym oraz w organizmach ssaków, głównie na błonach śluzowych. Wtórnie występują w mleku i na materiale roślinnym. Gdzie przy ograniczonym dostępie tlenu prowadzą samorzutną fermentację mlekową. 

Kiszenie roślin ma na celu zabezpieczenie ich przed rozkładem w wyniku różnych procesów mikrobiologicznych (rozkład białek, fermentacje dające produkty o przykrym zapachu, rozkład celulozy, skrobi itp.). Dobrze przygotowana kiszonka może być przechowywana przez długi czas. Zepsucie kiszonki bywa spowodowane przy dostępie powietrza przez rozwijające się na powierzchni grzyby z grupy Fungi imperfekti - Oidium lactis i drożdżaki. Użytkują one kwas mlekowy jako źródło energii, w wyniku czego odkwaszają kiszonkę. Wzrost pH umożliwia rozwój na masie roślinnej innych drobnoustrojów głównie bakterii i grzybów. 

1. Mikroflora mleka:

Mleko, dzięki swoim składnikom, jak białka (kazeina, globulina, albumina), aminokwasy, laktoza, tłuszcze, stanowi bardzo dobre podłoże do rozwoju różnych grup mikroorganizmów. Dojenie nawet w warunkach aseptycznych zawiera niewielką ilość (rzędu setek komórek w 1 cm³) bakterii, które przenikają do wymion kanałami strzykowymi. Są to na ogół drobnoustroje saprofityczne, z rodzaju Microccocus, ale mogą także występować potencjalnie chorobotwórcze szczepy z rodzaju Staphylococcus (np. Staphylococcus agalactiae - paciorkowiec bezmleczności, powodujący u krów zapalenie wymion). Znacznie ważniejsze jednak od zakażenia wewnętrznego mleka jest zakażenie zewnętrzne, powodowane przez mikroorganizmy występujące na skórze krów, w pomieszczeniu hodowlanym, paszy, czy ściółce oraz przenoszone przez obsługujących pracowników.

Spośród najczęściej występujących w mleku drobnoustrojów można wymienić bakterie fermentacji mlekowej, propionowej (ważne w procesie produkcji serów) bakterie fermentacji octowej oraz gnilne. Z tych ostatnich najpopularniejsze są Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Proteus vulgaris (rozkładający kazeinę do peptonu), a z grupy coli: E. coli, Aerobacter aerogenes. Oprócz bakterii, w mleku znajdujemy także drożdże i pleśnie. Drożdże, dostające się zwykle z paszy należą najczęściej do rodzaju Saccharomyces i Zygosaccharomyces. Najpowszechniej występujące gatunki grzybów to Mucor mucedo, Rhizopus nigricanes oraz Geotrichum candidum, rozwijające się w postaci białego nalotu na skwaśniałym mleku.

Za pośrednictwem mleka przenoszą się liczne choroby zakaźne, np.: brucelloza, gruźlica, pryszczyca - pochodzące od chorych krów oraz tyfus czy czerwonka, dostające się do mleka poprzez kontakt z wodą skażoną fekaliami lub wydzielinami ludzi chorych.

Badania mikrobiologiczne mleka jako artykułu powszechnego spożycia i surowca dla przemysłu przetwórstwa rolnego obejmują ocenę sanitarno-higieniczną oraz badanie przydatności technologicznej. 

• oznaczanie ogólnej liczby tlenowych drobnoustrojów mezofilnych.

• określenie miana coli w mleku

• próba reduktazowa z resazuryną

Próba reduktazowa wskazuje na ogólne zakażenie mleka. Rozwijające się w mleku drobnoustroje zużywają rozpuszczony w nim tlen, obniżając w ten sposób potencjał oksydoredukcyjny. Wzrasta zapotrzebowanie na akceptator wodoru. Po w wyczerpaniu tlenu akceptorem stają się dodane do badanego mleka barwniki, takie jak resazuryna lub błękit metylenowy. W wyniku przyłączenia wodoru (redukcji) barwniki przechodzą w formę leukozwiązków (bezbarwną).

Szybkość zużycia tlenu, czyli odbarwienia barwników zależy od:

• liczby drobnoustrojów,

• rodzaju drobnoustrojów,

• aktywności drobnoustrojów

Redukcja barwników następuje przede wszystkim w wyniku działalności drobnoustrojów bakterii z grupy pałeczki okrężnicy (coli). Bakterie proteolityczne i psychrofilne, mogące w dużym stopniu wpływać na jakość mleka, nie mają zdolności odbarwiania resazuryny jak i błękitu metylenowego. 

Resazuryna w roztworze w stanie nie zredukowanym ma zabarwienie niebieskie. Tracąc tlen przechodzi w pierwszym stadium redukcji w resorufinę, która jest różowa, następnie w drugim stadium przy całkowitej redukcji - w bezbarwną dwuhydroresorufinę. Przy przejściu resazuryny nie zredukowanej w 1 stadium redukcji pomiędzy zabarwieniem niebieskim, a różowym występuje cały szereg barw pośrednich, jak niebieskofioletowa i czerwonofioletowa.

W początkowym okresie przechowywania mleka, bezpośrednio po udoju zawartość mikroflory spada na skutek bakteriostatycznego i bakteriobójczego działania substancji zawartych w mleku, takich jak:

• lizozym niszczący strukturę ścian komórkowych bakterii gramdodatnich

• lakteniana hamująca rozwój paciorkowców mlekowych

Zawarte w mleku leukocyty również niszczą bakterie drogą fagocytozy. Czas trwania fazy bakteriobójczej w mleku jest odwrotnie proporcjonalny do temperatury mleka i liczby bakterii w mleku.

Rodzaj rozwijającej się mikroflory w przechowywanym świeżym mleku zależy od temeratury przechowywania. W niskich temperaturach (0-10°C) najlepiej rozwijają się psychrofile, drobnoustroje fluoryzujące i alkalizujące wytwarzające enzymy proteolityczne i syntetyzujące witaminy. W temperaturze 10-15°C poza psychrofilami rozwijają się paciorkowce, pałeczki z grupy okrężnicy i heterofermentatywne bakterie fermentacji mlekowej. W temperaturze 15-30°C najlepiej rozwijają się paciorkowce mlekowe (Streptococcus lactis). W wyższej temperaturze (30-40°C) następuje silny rozwój pałeczki z grupy coli i bakterie homofermentacji mlekowej. W temperaturze ponad 40°C rozwijają się laseczki homomlekowe (Lactobacillus), drożdże fermentujące laktozę, paciorkowce, enterokoki (Str. faecelis) i niektóre szczepy E. coli. 

W mleku pozostawionym w temperaturze pokojowej najpierw rozwijają się drobnoustroje proteolityczne, następnie bakterie fermentacji pseudomlekowej i pałeczki z grupy coli. W następnym stadium rozwijają się paciorkowce mlekowe zakwaszające środowisko do pH=4,5-4,1. Przy tym poziomie kwasowości zahamowany zostaje rozwój bakterii proteolitycznych, a dalsze ukwaszanie prowadzą bakterie mlekowe z rodzaju Lactobacillus, których działalność zostaje zahamowana na skutek zbyt dużej ilości kwasu mlekowego (1,5-3%). Na powierzchni ukwaszonego mleka rozwijają się pleśnie i drożdże powierzchniowe zużywające kwas mlekowy. Obniżenie kwasowości mleka w następstwie rozwoju drożdży i pleśni umożliwia ponowny rozwój drobnoustrojów gnilnych powodujących dalsze zmiany aż do całkowitej mineralizacji mleka. 

Mleko możemy utrwalić przez schłodzenie lub przez ogrzanie.

Chłodzenie mleka powoduje zahamowanie rozwoju drobnoustrojów przez obniżoną temperaturę, ale całość mikroflory pozostaje żywa. W temperaturze 2-5°C możemy przechowywać przez 2-3 dni. 

Pasteryzowanie mleka powoduje częściowe zniszczenie mikroflory. Zależnie od przeznaczenia mleka przeprowadza się trzy rodzaje pasteryzacji:

• pasteryzację niską w tem. 62-65°C przez 20-30 min, gdy mleko ma być użyte do produkcji serów (mleko traci pewne wartości smakowe)

• pasteryzację wysoką, krótkotrwałą w tem. 72-78°C przez 10-40 sekund w przypadku mleka konsumpcyjnego

• pasteryzację momentalną w tem. 85-95°C przez 2-3 sekundy, gdy mleko przeznaczone jest do produkcji mleka zagęszczonego lub mleka w proszku

Skuteczność pasteryzacji mleka powinna wynosić co najmniej 99,5 %.

"Sterylizację" mleka przeprowadza się metodą UHT (ultra high temperature). W metodzie tej przegrzana para wodna jest wtryskiwana do mleka wytwarzając temperaturę 135-150°C, w której mleko pozostaje przez 1-2 s, a następnie jest rozpylane przez specjalną dyszą podczas którego zostanie usunięta woda wprowadzona podczas wstrzyknięcia pary. Tak przygotowane mleko nie ulega zepsuciu przez kilka tygodni, jakkolwiek zawiera mikroflorę resztkową. 

Część praktyczna

a) oznaczanie ogólnej liczby tlenowych drobnoustrojów mezofilnych w mleku metodą płytkową

Każda para wysiewa 1 cm³ mleka w rozcieńczeniu 10^-5 lub 10^-6 na jałową płytkę Petriego i zalewa ostudzoną pożywką dla bakterii fermentacji mlekowej o składzie:

laktoza - l0 g 
glukoza - l0 g 
pepton - 5 g 
ekstr. droż. - 0,1g 
CaCO₃ - 5 g 
H₂O - 1000 cm³ 
agar - 12 g
purpura bromokrezolowa - l0 cm³

Założone hodowle inkubujemy w temp. 28^oC przez 1 tydzień.

b) określenie miana coli w mleku - określenie stopnia zanieczyszczenia mleka pałeczkami okrężnicy. 

Każda para wysiewa określoną próbę mleka do 10 cm³ pożywki Eijkmana wg następującego schematu:

Pierwsza para: wysiewa 0,1 cm³ mleka do 10 cm³ pożywki i dokładnie ale delikatnie miesza.

Druga para: wysiewa 1 cm³ pożywki (z wysianym mlekiem) pierwszej pary do 9 cm³ świeżej pożywki i dokładnie ale delikatnie miesza.

Trzecia para: wysiew 1 cm³ pożywki (z wysianym mlekiem) drugiej pary do 9 cm³ świeżej pożywki i dokładnie ale delikatnie miesza.

Czwarta para: wysiewa 1 cm³ pożywki (z wysianym mlekiem) trzeciej pary do 9 cm³ świeżej pożywki i dokładnie ale delikatnie miesza.

Wysiano: 

• Pierwsza para: 0,1 cm³ mleka,

• Druga para: 0,01 cm³ mleka,

• Trzecia para: 0,001 cm³ mleka, 

• Czwarta para: 0,0001 cm³ mleka

• Wysiany materiał inkubować 24 - 48 h w temp. 37^o C.

2. Mikroflora kiszonek - oznaczanie miana siarkowodoru w soku z kiszonki z kapusty - założenie hodowli.

Kiszenie polega na fermentacyjnej przemianie cukrów w kwas mlekowy, który obniża pH środowiska i jednocześnie sam w postaci nie zdysocjowanej jest inhibitorem wzrostu wielu drobnoustrojów. W wyniku fermentacji i gromadzenia się kwasu pH spada poniżej 4,2 - zwykle do 3,5. Trwałe produkty uzyskuje się tylko w przypadku kiszenia surowców zawierających wystarczająco dużo cukru. Z kiszeniem wiąże się pojęcie minimum cukrowego; jest to najmniejsza zawartość cukru w suchej masie surowca pozwalająca na utrzymanie w wyniku fermentacji mlekowej takiej ilości kwasu, aby pH spadło przynajmniej do 4,2. Takie pH zabezpiecza kiszonki przed rozwojem bakterii gnilnych i masłowych, które jako beztlenowce zużywają mleczany znalazłyby w słabo zakwaszonym środowisku doskonałe warunki rozwoju. Niektóre pasze zielone, np. motylkowe zawierające mało cukru, kisi się łącznie z zielonkami zawierającymi nadmiar cukru w suchej masie, jak np. kukurydza lub buraki.

Kiszoną kapustę otrzymuje się przez poddanie fermentacji mlekowej pociętych na paski liści kapusty. Pocięte liście ubija się warstwami, dodając jednocześnie sól. Ubijanie ma na celu usunięcie powietrza oraz przyśpieszanie wyciekania soku komórkowego. W soku komórkowym znajduje się ok. 4% cukrów, które ulegają fermentacji. W pierwszym etapie fermentacji (do 10 dni) w prawie obojętnym odczynie rozwijają się oprócz bakterii mlekowych przetrwalnikujące tlenowce, bakterie z grupy coli oraz drożdże. Gdy pH zaczyna spadać, zmniejsza się liczba pałeczek okrężnicy, a zwiększa się liczba bakterii heteromlekowych, głównie z gatunku Leuconostoc mesenterioides, która oprócz kwasu mlekowego wytwarza produkty takie jak kwas mrówkowy, propionowy, masłowy, bursztynowy, octowy, etanol, dwutlenenek węgla, i inne związki wpływające na smak i aromat kapusty. Przy pH 4,0 zostaje zahamowany całkowicie rozwój bakterii z grupy coli i bakterii gnilnych.

W drugim etapie fermentacji trwającym od 10 do 16 dni rozwijają się bakterie homofermentywne, takie jak Lactobacilus palantatum i pseudomlekowe Pediococcus ceravisae. Drobnoustroje te wytwarzają substancje zapachową - acetylocholinę.

W końcowym etapie działają również bakterie należące do heterofermentatywnego gatunku Lactobacillus brevis, wytwarzające oprócz kwasu mlekowego kwas octowy i zużywające mannitol.

Po około 2 tygodniach fermentacji kapusta powinna zawierać 1,5-1,8% kwasu mlekowego i wykazywać pH 3,4-3,5. Ukiszoną kapustę pozostawia się na kilka tygodni w temperaturze 10°C. W tym czasie zachodzą reakcje chemiczne między związkami powstałymi w czasie fermentacji. Kapusta dojrzewa i nabiera odpowiednich cech.

Część praktyczna

Oznaczanie miana siarkowodoru w soku z kiszonki z kapusty - założenie hodowli.

Przygotować 10 cm³ soku z kapusty kiszonej świeżej i zepsutej. Jeżeli sok kwaśny (świeża) zalkalizować 0,1 % NaOH do odczynu obojętnego.

Studenci otrzymują sok rozcieńczony 1:10. Każda para wysiewa materiał wg schematu.

1 para wysiewa 1 cm³ soku rozcieńczonego 10^-1 do 9 cm³ pożywki (bulion z dodatkiem cysteiny), wymieszać i przekazać 2 parze (l:100).

2 para wysiewa 1 cm³ pożywki z wysianym sokiem przez 1 parę (sok rozcieńczony 10^-2) do 9 cm³ pożywki, wymieszać i przekazać 3 parze (l:1000).

Kolejne pary postępują jak wyżej aż  do uzyskania rozcieńczeń 10^-6 (sok ze świeżej kapusty) i 10^-9 (sok z kapusty zepsutej) 

Po wysianiu materiału do każdej probówki studenci wkładają pasek z bibuły przesyconej octanem ołowiu. Jeden z końców bibuły należy zahaczyć o brzeg probówki tak aby pasek nie zanurzył się w pożywce.

 3. Założenie hodowli tlenowych drobnoustrojów celulolitycznych na podłożu stałym i w pożywce płynnej.

Celuloza - błonnik jest głównym wielocukrem ścian komórkowych roślin. Składa się z monomerów b-D-glukozy (od kilku do kilku tys.) połączonych wiązaniami 1,4 b-glikozydowymi. Charakteryzuje ją odporność na czynniki chemiczne i mechaniczne, jest trudno rozpuszczalna.

Duże ilości błonnika dostają się wraz z resztkami roślinnymi do gleby, gdzie rozkładane przez drobnoustroje celulolityczne. Jest to grupa fizjologiczna drobnoustrojów zróżnicowana systematycznie (bakterie tlenowe i beztlenowe, promieniowce, np. Streptomyces, Streptosporangium, i grzyby, np. Cheatomium, Trichoderma. Wydzielają one do środowiska enzymy hydrolityczne zwane celulazami które prowadzą rozkład celulozy do dwucukru celobiazy. Następnie wewnątrzkomórkowo celobiaza jest hydrolizowana do glukozy, wykorzystywanej przez drobnoustroje jako źródło węgla i energii. Mikrobiologiczny rozkład błonnika jest bardzo ważnym ogniwem w obiegu węgla w przyrodzie. Tempo tego procesu stanowi wskaźnik aktywności biologicznej gleby. 

Część praktyczna

Założenie hodowli tlenowych drobnoustrojów celulolitycznych na podłożu stałym i w pożywce płynnej.

Każda para wysiewa grudki gleby do pożywki płynnej i na podłoże stałe z bibułą filtracyjną zastosowaną jako substrat celulozy.

4. Założenie hodowli tlenowych drobnoustrojów amylolitycznych na podłożu stałym i w pożywce płynnej.

Skrobia, wielocukier złożony z amylozy i amylopektyny, jest rozkładana enzymatycznie przez drobnoustroje zwane amylolitycznymi. Prowadzą one hydrolizę skrobi przez pozakomórkowy enzym a-amylazę do dekstryn i dwucukru maltozy. Maltoza jest rozkładana zewnątrz- lub wewnątrzkomórkowo do glukozy, która stanowi dla drobnoustrojów źródło węgla i substrat energetyczny.

W glebie drobnoustroje amylolityczne występują bardzo licznie. 

Drobnoustroje amylolityczne należą do różnych grup systematycznych. Są wśród nich liczne promieniowce z rodzaju Streptomyces, Nocardia, Micromonospora, grzyby z rodzajów Aspergillus, Rhizopus, Fusarium, Penicyllium, a także bakterie tlenowe z rodzajów Bacillus, Pseudomonas, Cytophaga i beztlenowe z rodzaju Clostridium.

Część praktyczna

Założenie hodowli tlenowych drobnoustrojów amylolitycznych na podłożu stałym i w pożywce płynnej.

Każda para wysiewa na jałową płytkę Petriego 1 cm³ zawiesiny glebowej w rozcieńczeniu 10^-5. Wysiany materiał studenci zalewają podłożem ze skrobią zastosowaną jako jedyne źródło węgla.

Zestawienie przykładowych drobnoustrojów  wymienionych w ćwiczeniu

Homofermentacja - ziarniaki z rodzaju: Streptococcus, Leuconostoc, pałeczki z rodzaju Lactobacillus, laseczki z rodzaju Streptobacterium, Thermobacterium. 

Heterofermentacja - Rodzaje: Betacoccus, Betabacterium

Rzekoma fermentacja mlekowa - bakterie z rodziny Enterobacteriaceae np. E. coli lub grzybów z klasy Zygomycetes np. Mucor, Rhizopus.

Drobnoustroje gnilne mleka 

Bakterie: Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Proteus vulgaris, E. coli, Aerobacter aerogenes.

Drożdże: Saccharomyces i Zygosaccharomyces.

Grzyby: Mucor mucedo, Rhizopus nigricanes, Geotrichum candidum

Drobnoustroje kiszonek (I etap) E. coli i drożdże, bakterie heteromlekowe Leuconostoc mesenterioides, (II etap) bakterie homofermentywne, Lactobacilus palantatum, pseudomlekowe Pediococcus ceravisae, heterofermentatywne gatunki Lactobacillus brevis (III etap) grzyby Geotrichum candidum i drożdżaki 

Drobnoustroje celulolityczne - bakterie tlenowe i beztlenowe, promieniowce, np. Streptomyces, Streptosporangium, i grzyby, np. Cheatomium, Trichoderma.

Drobnoustroje amylolityczne - promieniowce z rodzaju Streptomyces, Nocardia, Micromonospora, grzyby z rodzajów Aspergillus, Rhizopus, Fusarium, Penicyllium, a także bakterie tlenowe z rodzajów Bacillus, Pseudomonas, Cytophaga i beztlenowe z rodzaju Clostridium.

---