CHARAKTERYSTYKA GRONKOWCÓW
•Gram (+) ziarniaki
•Nie posiadają rzęsek
•Nie wytwarzają przetrwalników
•Występują w formie gron lub pojedynczych komórek
•Wytwarzają katalazę
•Wytwarzają koagulazę
•Mogą wytwarzać toksyny
PODZIAŁ GRONKOWCÓW
•KOAGULAZO (+) np. Staphylococcus aureus
-Chorobotwórczy dla człowieka
-Rezerwuarem jest człowiek
-Nosicielstwo - 40-50% populacji
-Wywołują
•Zatrucia pokarmowe
•Owrzodzenia
•Posocznice
•KOAGULAZO (-) np. Staphylococcus epidermidis
-Formy saprofityczne
-Składnik mikroflory skóry
-Składnik błon śluzowych
Intoksykacje - zatrucia pokarmowe wywołane przez gronkowce koagulazo (+), w wyniku wytworzenia toksyny
Do enzymów i toksyn (niektóre toksyny mogą działać jak enzymy) wytwarzanych przez gronkowce należą m.in..:
•katalaza - rozkład H2O2 do H2O i O2
•koagulaza - białko podobne do enzymu, powodujące krzepnięcie krwi cytrynianowej w obecności czynnika występującego w wielu surowicach, (czynnik surowicy + koagulaza = esteraza + krzepliwość)
•hialuronidaza - czynnik rozprzestrzeniania, ułatwia wnikanie i rozprzestrzenianie się gronkowców
•stafilokinaza - powoduje fibrynolizę, (rozpuszczenie skrzepu i rozprzestrzenianie procesu chorobowego)
•egzotoksyny:
»hemolizyna - wywołuje lizę erytrocytów (krwinek czerwonych),
»toksyna - rozkład sfingomieliny,
»leukocydyna - uszkadza leukocyty (krwinki białe), głownie granulocyty i makrofagi
• Enterotoksyny:
»toksyny oznaczone literami: A, B, C1, C2, D, E, F, (A i B odpowiedzialne za zatrucia pokarmowe)
»rozpuszczalne,
»wytwarzane przez ok.. 50% szczepów S. aureus,
»ciepłostałe (1000C/30`),
»oporne na działanie enzymów przewodu pokarmowego.
TESTY POMOCNICZE W RÓŻNICOWANIU GRAM (+) ZIARNIAKÓW
Kryterium badania |
Staphylococcus sp. |
Micrococcus sp. |
Enterococcus sp. |
Kształt komórki -ziarniak |
+ |
+ |
+ |
Gram (+/-) |
+ |
+ |
+ |
Wzrost w warunkach beztlenowych |
+ |
- |
|
Rozkład H2 O2 |
+/(-) |
- |
- |
Rozkład mannitolu |
+/- |
- |
- |
Rozkład glukozy (O/F) * |
F |
O |
F |
Wzrost w obecności 15% NaCl |
+ |
- |
+ |
Wzrost w obecności 40% żółci |
+ |
- |
+ |
Reakcja VP |
+ |
- |
-/+ |
Dekarboksylacja argininy |
+ |
-/+ |
+ |
•PN-75/A-04024. Produkty żywnościowe. Wykrywanie i ilościowe oznaczanie gronkowców chorobotwórczych (koagulazododatnich). (Ryby i produkty rybne).
•PN-93/A-8634/13. Mleko i przetwory mleczarskie. Badania mikrobiologiczne. Staphylococcus aureus (gronkowce chorobotwórcze)-wykrywanie obecności, oznaczanie NPL, oznaczanie liczby metodą płytkową.
•PN-94/A-82055-9. Mięso i przetwory mięsne. Badania mikrobiologiczne. Wykrywanie obecności i oznaczanie liczby Staphylococcus aureus.
•PrPN-EN ISO 6888-1(2). Mikrobiologia żywności i pasz. Horyzontalna metoda oznaczania liczby gronkowców koagulazododatnich (Staphylococcus aureus i innych gatunków). 1.Metoda z zastosowaniem pożywki Braid-Parkera. 2.Metoda z zastosowaniem pożywki agarowej z plazmą króliczą i fibrynogenem.
WYKRYWANIE OBECNOŚCI GRONKOWCÓW KOAGULAZODODATNICH W 1G PRODUKTU
NAMNAŻANIE
Posiew określonej ilości próbki i/lub jej rozcieńczeń do 3 probówek z pożywką Giolitti-Cantoni
Inkubacja 24-48h w 37˚C
Wstępne odczytanie wyników na podstawie redukcji tellurynu potasowego - zaczernienie
NAMNAŻANIE SELEKTYWNE
Posiew redukcyjny na pożywkę selektywną Baird-Parkera
Inkubacja 24-48h w 37˚C
Wybór 5 charakterystycznych kolonii wytwarzających koagulazę (czarne, otoczone mleczną strefą zmętnienia `egg-yolk') i posiew na pożywkę BHI
Inkubacja 18-24h w 37˚C
TEST POTWIERDZAJĄCY
Potwierdzenie zdolności wytwarzania koagulazy testem probówkowym z osoczem króliczym (wynik dodatni - wytworzenie wyraźnego skrzepu, sprawdzane po 1,3,6 i 24h
PODŁOŻE |
SKŁAD PODŁÓŻ |
CEL ZASTOSOWANIA |
CHARAKTERYSTYKA |
Giolitti-Cantoni
|
Enzymatyczny hydrolizat kazeiny Ekstrakt mięsny Ekstrakt drozdzowy LiCl NaCl Mannitol Glicyna Pirogronian sodu Telluryn potasu |
Namnażająco-wybiórcze |
Zaczernienie w wyniku redukcji tellurynu
|
Baird-Parker
|
Ekstarkt mięsny Ekstrakt drozdzowy Pepton LiCl Agar Glicyna Pirogronian sodu Telluryn potasowy Żółtko jaja |
Wybiórczo-różnicujące
|
Czarne, gładkie, błyszczące, wypukłe, otoczone przezroczysta lub opalizująca sterfa (egg-yolk)
|
Testy potwierdzające
|
rozkład mannitolu - wytwarzanie koagulazy - wytwarzanie katalazy |
|
- Kolonie żółte - Ścięcie osocza krwi - Rozkład H2O2 |
Wzrost gronkowców na podłożu Baird Parkera
Kolonie typowe- czarne, gładkie, błyszczące, wypukłe; średnica 1-1,5mm(24h), 1,5-2,5mm(48h), otoczone strefa przeźroczystą lub opalizującą;
Kolonie nietypowe - czarne, szaroczarne z białą obwódką, błyszczące, strefa przeźroczysta słabo zaznaczona lub jej brak, niekiedy wzrost w postaci szorstkich kolonii.
TEST NA KOAGULAZĘ WOLNĄ
- rozcieńczone, jałowym roztworem fizjologicznym NaCl, osocze krwi królika rozlać, po 1ml, do małych probówek aglutynacyjnych,
- do każdej probówki dodać po 0,1 ml bulionowej hodowli badanego szczepu,
- zawartość probówki wymieszać przez wstrząsanie,
- wstawić do cieplarki o temp. 37C
-wyniki odczytywać co 1h do 6h
(pozostawienie probówki w cieplarce do następnego dnia wytworzony
skrzep może ulec rozpuszczeniu pod wpływem wytwarzanej przez szczep
fibrynolizyny; mogą też wystąpić dodatnie reakcje nieswoiste)
TEST NA KOAGULAZĘ ZWIĄZANĄ
(szybki test metodą szkiełkową)
* do kropli plazmy króliczej na szkiełku przedmiotowym wprowadzić ezą materiał pobrany z pojedynczej kolonii na AO
* w przypadku obecności koagulazy związanej ma miejsce natychmiastowe zlepianie się (5-15 sec.) komórek
Większość szczepów wytwarzających koagulazę wolną wytwarza również koagulazę związaną