damps kinga |
brzezińska marta |
dutkowska anna |
andrzejewski marcin |
eichstaedt katarzyna |
kowalska małgorzata |
kałowska małgorzata |
kolassa ilona |
kołpak milena |
grochowska katarzyna |
czerwińska patrycja |
gornowicz katarzyna |
BIELICKA MARTA |
JANKOWIAK IZABELLA |
Data odrobienia ćwiczenia: 20.04.2010
Data oddania sprawozdania: 27.04.2010
1) Podstawowe pojęcia
Chromatografia jest to fizyczna metoda rozdzielania, w której składniki rozdzielone ulegają podziałowi między dwie fazy:
fazę ruchomą którą jest --> płyn[Author:.] przemieszczający się przez nieruchome złoże lub wzdłuż niego w określonym kierunku
fazę stacjonarną która jest jedną z dwóch faz tworzących układ chromatograficzny; może być stała, żelowa lub ciekła
Układ chromatograficzny składa się z układu technicznego, który składa się z:
Systemu dozowania (dozownik)
Kolumny (właściwy element chromatograficzny)
Detektora
Chromatogram jest to graficzny obraz zmian detektora rejestrującego wyciek z kolumny
Czas retencji jest to ilość czasu potrzebna do przejścia przez całą kolumnę określonego składnika analizowanej mieszaniny do pojawienia się maksimum piku
Czas retencji całkowity czas od wprowadzenia mieszaniny do rozdziału, do pojawienia się na chromatogramie maksimum piku
Czas retencji martwy jest to czas retencji substancji obojętnej względem fazy stacjonarnej
Współczynnik retencji (k) jest to stosunek ilości czasu jaki substancja rozpuszczona spędza w fazie stacjonarnej i ruchomej (gaz nośny).
k = (tR - tM) / tM = t'R / tM
tR = czas retencji
t'R = redukowany czas retencji
tM = czas retencji związku nie zatrzymywanego
Selektywność wynika z oddziaływania określonych związków chemicznych z fazą stacjonarną kolumny
Sprawność jest to zdolność kolumny do wytwarzania wąskich pików, jej miarą jest ilość półek teoretycznych
Rozdzielczość charakteryzuje wpływ selektywności i sprawności
2) Spektometria mas
Jest to uniwersalna technika analityczna, zaliczana do metod spektroskopowych, której podstawą jest pomiar stosunku masy do jej ładunku elektrycznego (m/z). Współcześnie istnieje wiele odmian tej techniki, z których każda posiada inne zastosowanie i wymaga stosowania aparatów o innej konstrukcji. Wszystkie te techniki są jednak oparte na jonizacji cząsteczek lub atomów, a następnie detekcji liczby i stosunku masy do ładunku (m/z) powstających jonów. Wyniki działania spektrometru mas są przedstawiane w postaci tzw. widma masowego.
Spektrometria mas służy do:
identyfikacji związków chemicznych i ich mieszanin,
ustalania struktury związków chemicznych,
ustalania ich składu pierwiastkowego,
ustalania składu izotopowego analizowanych substancji, co m.in. umożliwia określenie ich źródła pochodzenia
precyzyjnego ustalania składu złożonych mieszanin związków o wysokich masach molowych w proteomice, badaniach materiałowych i chemii polimerów.
Niezależnie od konstrukcji i przeznaczenia, we wszystkich spektrometrach mas występują następujące elementy:
Schemat ideowy zasady działania spektrometru mas
analizator - w którym wcześniej powstałe jony ulegają rozdziałowi na podstawie stosunku ich masy do ładunku.
detektor - urządzenie "zliczające" jony napływające z analizatora.
Budowa i działanie spektrometru mas
Działanie tradycyjnego spektrometru mas opiera się na odchylaniu strumienia jonów badanej substancji w polu elektrycznym. Wszystkie cząsteczki analizowane w spektrometrze mas muszą mieć ładunek elektryczny. Wewnątrz spektrometru mas panuje próżnia, dzięki czemu ruch jonów nie jest zakłócany przez zderzenia z cząsteczkami gazów.
Pierwszym przedziałem spektrometru mas jest źródło jonów. Urządzenie to przeprowadza substancje analizowane w spektrometrze w jony unoszące się w fazie gazowej. Zjonizowane cząsteczki przechodzą do dalszych przedziałów spektrometru mas, gdzie formowana jest wiązka jonów. Wiązka ta jest kierowana do analizatora masy.
Analizator masy rozdziela jony ze względu na stosunek ich masy do ładunku. Jony kierowane są do detektora, który zamienia w sposób ilościowy sygnał w postaci prądu jonowego na sygnał elektryczny, który jest rejestrowany przez komputer w postaci widma stosunku masy do ładunku elektrycznego (nazywanego często widmem masowym). W widmie takim na osi poziomej odłożone są stosunki mas do ładunków w thompsonach (1 Th = 1 Dalton / liczbę ładunków elementarnych jonu), na osi pionowej intensywności (liczba jonów zarejestrowanych przez spektrometr).
Typowy przykład widma masowego. Widmo masowe mieszaniny peptydów wykonane przy pomocy spektrometru mas ESI-Q-TOF (spektrometr tandemowy z jonizacją typu electrospray i dwoma analizatorami - kwadrupol i TOF). Oś pozioma:stosunek masy (m) do ładunku (z) jonu. Oś pionowa: liczba zliczeń danego jonu przez detektor
Rozdzielczość spektrometru mas
Rozdzielczość jest jednym z najważniejszych parametrów charakteryzujących spektrometr mas. Miarą rozdzielczości spektrometru jest zdolność do rozróżnienia dwóch jonów o pewnej różnicy stosunku masy do liczby ładunków elementarnych jonów (m/z). Spektrometr o rozdzielczości 1000 będzie umożliwiał rozróżnienie dwóch cząsteczek o m/z równym 1000 i 1001. Można przyjmować różne kryteria pomiaru rozdzielczości. Najczęściej uznaje się, że jeśli na widmie m/z dolina pomiędzy pikami dwóch jonów jest głębsza niż 50% wysokości pików, to są one rozróżnione. Rozdzielczość nie jest zależna tylko od konstrukcji analizatora masy. Na rozdzielczość pomiaru wpływa wiele czynników. Często w ramach jednego widma obserwuje się piki od jonów zarejestrowanych z różną rozdzielczością
Rozdzielczość spektrometru mas. Niebieskie linie ilustrują jak wyglądałoby widmo zmierzone przez analizator o nieskończonej rozdzielczości. Linie zielona i czerwona - widmo zmierzone przez analizatory o rozdzielczości 200 i 2000
Techniki jonizacji
Istnieje wiele metod jonizacji cząsteczek w spektrometrach mas. Do metod najczęściej używanych należą:
Jonizacja elektronami (Electron Ionisation - EI) - jonizacja przy pomocy wiązki elektronów. Jonizacja odbywa się w próżni. Metoda ta powoduje zwykle fragmentację badanych cząsteczek. EI charakteryzuje się stosunkowo małą wydajnością - poniżej 1% cząsteczek ulega jonizacji.
Elektrorozpylanie (Electrospray, ESI), polegające na rozpylaniu cieczy zawierającej badaną substancję z igły, do której przyłożono wysokie napięcie (zwykle 1-5 kV) pod ciśnieniem atmosferycznym. Jest to jedna z łagodnych metod jonizacji - zwykle nie powoduje fragmentacji badanych cząsteczek. Metoda ta jest bardzo często stosowana w badaniach nad wielkocząsteczkowymi biopolimerami takimi jak białka i oligonukleotydy.
Termorozpylanie (Termospray, TE) - jonizacja przez podgrzanie przy pomocy prądu elektrycznego roztworu zawierającego sól i analizowaną substancję wewnątrz stalowej kapilary. Gorąca substancja jest rozpylana w komorze próżniowej z prędkością naddźwiękową.
Jonizacja chemiczna (Chemical Ionisation, CI) - jony wytwarzane są na skutek zderzeń cząsteczek badanego związku chemicznego z jonami pierwotnymi obecnymi w źródle jonów. Jest to metoda nie powodująca fragmentacji cząsteczek (łagodna jonizacja). Jonizacja odbywa się zwykle przy ciśnieniu rzędu 60 Pa.
Bombardowanie jonami (spektrometria mas jonów wtórnych - Secondary Ion Mass Spectrometry - SIMS) Metoda ta początkowo była stosowana do substancji przewodzących prąd lub substancji naniesionych na metalowe płytki. Obecnie metodę SIMS stosuje się z powodzeniem do substancji nie przewodzących prądu. Istnieje odmiana techniki SIMS, w której badana substancja jest rozpuszczona w ciekłej matrycy (najczęściej glicerolu). Technika ta jest nazywana czasami LSIMS (Liquid Secondary Ion Mass Spectrometry) lub FIB (Fast Ion Bombardment).
Desorpcja laserowa (Laser Desorption - LD) - w której jonizacja następuje przez naświetlanie próbki silnym laserem, a zatem bombardującymi cząstkami są wysokoenergetyczne fotony.
Desorpcja laserowa z udziałem matrycy (Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation - MALDI) - w której stosuje się jonizację laserową, ale z tak dobraną energią wiązki, aby nie doprowadzać do fragmentacji cząsteczek (łagodna metoda jonizacji), lecz tylko do ich "wybijania" ze specjalnie przygotowanej matrycy. Matryca absorbuje energię lasera, która jest później przekazywana do analizowanych cząsteczek. Metoda ta jest bardzo często stosowana w badaniach nad biopolimerami i polimerami syntetycznymi.
Plazma wzbudzona indukcyjnie (ICP) - jonizowana substancja jest wprowadzana do plazmy płomienia palnika znajdującego się w kwarcowej rurze. Rura otoczona jest cewką, przez którą przepływa prąd zmienny o wysokiej częstotliwości. Plazma ogrzewa się do temperatury rzędu 10 000 K w wyniku wzbudzenia polem magnetycznym wytworzonym przez prąd płynący w cewce. Metoda nadaje się doskonale do analizy pierwiastków metalicznych.
Wiele metod jonizacji cząsteczek takich jak FAB, EI i LD prowadzi do fragmentacji cząsteczek chemicznych w trakcie jonizacji, co powoduje, że różne spektrometry mogą generować różne widma dla tego samego związku chemicznego. Fragmentacja cząsteczek może pomagać w analizie, gdy badany jest jeden związek chemiczny. Pomiar masy takiego związku często nie wystarcza do jego identyfikacji, na którą pozwala analiza charakterystycznego wzoru fragmentacji takiego związku. W przypadku mieszanin wielu związków chemicznych, wtórne reakcje między jonami pochodzącymi z różnych związków, uniemożliwiają praktyczną analizę danych.
Typowym przykładem zastosowania spektrometrii mas do analizy mieszanin są badania proteomiczne, gdzie prawie zawsze występują złożone mieszaniny peptydów. Badania te są możliwe dzięki stosowaniu łagodnych metod jonizacji takich jak ESI i MALDI. Podczas stosowania łagodnych metod jonizacji tracona jest informacja o wzorze fragmentacji cząsteczek. Problem ten rozwiązuje zastosowanie tandemowych spektrometrów mas.
Detektory
Zadaniem detektora w spektrometrze mas jest rejestracja jonów, przechodzących przez analizator. Najprostszym i najstarszym detektorem jonów jest płyta fotograficzna. Obecnie płyty fotograficzne zostały zastąpione detektorami przekazującymi informację w postaci sygnałów elektrycznych. Sygnały te są we współczesnych spektrometrach mas przetwarzane na postać cyfrową i dalej analizowane i przechowywane z wykorzystaniem komputerów. Można wyróżnić kilka najczęściej stosowanych typów detektorów:
Puszka Faradaya - jest to metalowa, cylindryczna komora z otworem przez który wlatują jony. Jony wpadające do detektora trafiają na dno puszki i oddają swój ładunek. Powstający w ten sposób prąd jest mierzony. Detektory te charakteryzują się małą czułością.
Powielacz elektronowy - detektor zbudowany jest z serii płytek, do których przyłączono wysokie napięcie. Jony po uderzeniu w pierwszą płytkę (dynodę konwersyjną), powodują emisję elektronów. Elektrony te uderzają w kolejną płytkę (dynodę) powodując wybicie większej liczby elektronów. Z każdej, kolejnej płytki detektora wybijane jest coraz więcej elektronów - sygnał jest wzmacniany. Elektrony trafiają ostatecznie na anodę powodując przepływ prądu, który jest mierzony. W nowszych konstrukcjach powielaczy elektronowych serię dynod zastępuje się zakrzywioną zwężającą się rurą (powielacz elektronowy o dynodzie ciągłej). Elektrony uderzają wielokrotnie w ściany rury powodując emisję kolejnych elektronów. Dzięki kaskadowemu wzmocnieniu sygnału powielacze elektronowe są detektorami bardzo czułymi.
Detektor mikrokanalikowy - detektor zbudowany z płytki z niewielkimi (4-25 μm), zakrzywionymi otworami. Powierzchnia otworów pokryta jest półprzewodnikiem mającym zdolność emisji elektronów. Na stronie wejściowej płytki utrzymywany jest potencjał ujemny (napięcie rzędu 1 kV) w stosunku do strony wyjściowej. Jony wpadają do kanalików i zderzają się ze ścianami otworów powodując kaskadową emisję elektronów, podobnie jak w powielaczu elektronowym. Za każdym z kanalików znajduje się metalowa anoda zbierająca elektrony. Sygnał powstały w ten sposób jest mierzony.
Detektor fotopowielaczowy - składająca się z dwóch dynod konwersyjnych (jedna dla jonów dodatnich druga dla jonów ujemnych), ekranu fluorescencyjnego i fotopowielacza. Jony wpadające do detektora uderzają w dynodę konwersyjną powodując emisję elektronów. Elektrony są kierowane na ekran fluorescencyjny przy pomocy pola elektrycznego. Po uderzeniu elektronu w ekran emitowane są fotony, które trafiają do fotopowielacza. Fotopowielecz wzmacnia sygnał, który potem jest rejestrowany.
Detekcja w analizatorze cyklotronowego rezonansu jonów (ICR) - Analizatory ICR są jednocześnie detektorami jonów, nie wymagają one instalacji dodatkowych detektorów.
Połączenie spektrometrii mas z chromatografią
W analizach mających na celu identyfikację substancji zwykle ma się do czynienia z mieszaninami związków chemicznych. Identyfikacja wielu związków chemicznych znajdujących się w jednej próbce jest zwykle niemożliwa, jeśli stosuje się tylko spektrometr mas. Problem ten można rozwiązać łącząc spektrometrię mas z różnymi technikami rozdziału substancji, zwykle z chromatografią. Metodami najczęściej stosowanymi w połączeniu ze spektrometrią mas są chromatografia gazowa (GC) i wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC).
W układzie takim wszystkie substancje wychodzące z chromatografu kierowane są do źródła jonów w spektrometrze mas. Podczas analizy mieszanin, z chromatografu wydostają się kolejne, rozdzielone substancje. Spektrometr nie analizuje całej mieszaniny w jednym momencie, tylko kolejno poszczególne związki chemiczne. Oprócz informacji o masach i wzorze fragmentacji substancji podawanych przez spektrometr mas otrzymujemy informację o czasie retencji związków na kolumnie chromatografu.
Podczas analiz można mieć do czynienia z tak złożonymi mieszaninami, że w jednym momencie z chromatografu wychodzić będzie wiele związków chemicznych. W takich sytuacjach można użyć tandemowego spektrometru mas połączonego z chromatografem. W przypadku mniej złożonych mieszanin można zamiast chromatografii zastosować rozdział związków w pierwszym analizatorze tandemowego spektrometru mas.
Spektrometria mas bywa często łączona z elektroforezą kapilarną, która nie jest klasyfikowana jako metoda chromatograficzna. Elektroforeza kapilarna podobnie jak chromatografia cieczowa służy do rozdziału substancji w fazie ciekłej. Systemy, w których połączono spektrometr z elektroforezą kapilarną służą zwykle do analizy białek i kwasów nukleinowych
Najczęściej stosowane konfiguracje systemów chromatograficznych ze spektrometrami mas:
Chromatografia gazowa i spektrometr mas (GC-MS)
Chromatograf rozdziela analizowaną próbkę na pojedyncze związki chemiczne, które są kolejno kierowane do spektrometru mas celem ich jednoznacznej identyfikacji. Technika ta określana skrótem GCMS jest powszechnie stosowana w przemyśle chemicznym i spożywczym, do analizy zanieczyszczeń środowiska, w badaniach biochemicznych, w badaniu próbek moczu i krwi sportowców w ramach testów antydopingowych.
Chromatografia cieczowa i spektrometr mas (LC-MS)
Wysokociśnieniowe chromatografy cieczowe (HPLC) są łączone ze spektrometrami mas. Najczęściej stosowanym w tym przypadku źródłem jonów jest elektrorozpylacz (ESI). W układach tych stosuje się często spektrometry tandemowe ze względu na dużą złożoność analizowanych próbek. Systemy takie są zwykle stosowane w badaniach proteomicznych do identyfikacji białek ze złożonych mieszanin, wykrywania zanieczyszczeń środowiska oraz w przemyśle spożywczym.
Widmo masowe- widmo powstałe przez rozdzielenie w spektromerze mas strumienia jonów według stosunku ich masy do ładunku elektrycznego, w którym postawie szczególne linie opowiadają różnym masom. Na podstawie widm masowych ustalono procentowe zawartości poszczególnych izotopów w pierwiastkach, a także precyzyjne wyznaczono masy jąder atomowych
WWA
Wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne (WWA) to obszerna grupa związków
chemicznych o budowie pierścieniowej, charakteryzujących się zbliżonymi własnościami
fizykochemicznymi. Chociaż znanych jest ponad 100 różnych WWA najczęściej w środowisku
występuje około 17 związków chemicznych. Wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne należą do grupy najpowszechniej występujących, trwałych zanieczyszczeń organicznych. Głównymi źródłami WWA są produkty niepełnego spalania paliw kopalnych, lotne pyły i popioły powstające ze spalania paliw lub utylizacji odpadów oraz działalność przemysłu ciężkiego związanego z przetwarzaniem węgla i ropy naftowej (koksownie, rafinerie, huty żelaza, aluminium i miedzi, produkcja i wykorzystania smoły i kreozotu). Szacuje się iż, szczególnie w okresie zimowym, poważnym źródłem WWA w środowisku jest tzw. niska emisja, pochodząca z indywidualnych źródeł ciepła. Jednak najpoważniejszy udział w emisji WWA na terenach zurbanizowanych ma transport samochodowy. Wśród źródeł naturalnych wymienia się pożary lasów i wybuchy wulkanów. W aspekcie ogólnego skażenia, ilości WWA pochodzące ze źródeł naturalnych i stanowiące "naturalne tło" są niewielkie w porównaniu z ilościami będącymi wynikiem działalności człowieka. WWA nie występują w środowisku w postaci pojedynczych związków - zawsze tworzą mieszaniny wieloskładnikowe. Skład ilościowy i jakościowy tych mieszanin zależy od rodzaju materiału spalanego oraz warunków, w jakich zachodzi proces spalania.
PCB
Struktura chemiczna PCB. Pozycje, w których mogą znajdować się atomy chloru oznaczone są liczbami; "n" - liczba atomów chloru w danym pierścieniu
Polichlorowane bifenyle (PCB) występują zazwyczaj jako mieszanina kongenerów. PCB
otrzymywano na skalę techniczną w bezpośredniej reakcji bifenylu z chlorem, uzyskując
mieszaniny kongenerów o składzie zależnym od proporcji chloru i bifenylu oraz warunków
przeprowadzanej syntezy. polichlorowane bifenyle mogą występować w formie 209 kongenerów różniących się liczbą atomów chloru podstawionych w różnym miejscu cząsteczki bifenylu. PCB charakteryzują się słabym przewodnictwem elektrycznym, wysoką odpornością na
rozkład termiczny i na inne związki chemiczne, niską palnością, oraz wysoką stabilnością
chemiczną. Dzięki wymienionym właściwościom fizykochemicznym są one skutecznymi
preparatami używanymi w procesach smarowania, chłodzenia i izolacji. Fizyczne właściwości,
które decydują o przydatności PCB dla przemysłu, sprawiają również, że stanowią one poważne
zagrożenie dla środowiska. Chociaż w większości państw zakazano produkcji PCB już w latach 70-tych, to w dalszym ciągu w użytku znajdują się duże ich ilości. Spośród szacowanych 1,5 miliona ton PCB wyprodukowanych na całym świecie wciąz około 2/3 pozostaje w użyciu lub w
środowisku.
PCB mogą kumulować się w organizmach zwierząt i ludzi wzdłuŜ powiązań troficznych,
gdzie w przypadku zatruć ostrych wywołują uszkodzenia wątroby, śledziony i nerek. Szkodliwe
działanie PCB polega równieŜ na zakłóceniu funkcji endokrynnego wydzielania hormonów
sterydowych, co skutkuje zaburzeniami reprodukcyjnymi. Dodatkowo spalanie odpadów bądź
materiałów zawierających PCB moŜe prowadzić do powstania wielokrotnie bardziej toksycznych
polichlorowanych dibenzodioksyn i dibenzofuranów.
Procedura ćwiczenia:
Do fiolki odważyliśmy 1,06356g osadu
Osad zwilżyliśmy acetonem, aby cały osad związał się później ze wzorcem.
Dodaliśmy 20µl wzorca wewnętrznego. Dla WWA: naftalen-d8 i benzo[a]antracen-d12. Dla PCB są to związki z grupy PCB zawierający izotop --> 13C[Author:.] .
Następnie zalewaliśmy osad dichlorometanem dwukrotną objętością.
Wytrząsamy 20minut - zachodzi ekstrakcja ciało stałe-ciecz, związki hydrofobowe przechodzą do rozpuszczalnika organicznego- dichlorometanu.
Następnie zdekantowaliśmy dichlorometan znad --> osadu[Author:.]
W kolejnym etapie przystąpiliśmy do oczyszczenia ekstraktów z siarki. Siarka w swoim widmie ma pik identyczny jak jeden z oznaczanych związków, więc aby uzyskać miarodajne wyniki należy siarkę usunąć. W tym celu do kolumienki wsypaliśmy porcję miedzi; następnie aktywowaliśmy miedź roztworem HCl: woda (1:1) - miedź zmienia zabarwienie na jasnoróżowe; następnie zobojętniliśmy wodą
i wysuszyliśmy acetonem.
Kolejnym etapem było oczyszczanie na kolumience SPE. Do kolumienki handlowej nanieśliśmy warstwę aktywowanej miedzi, kondycjonowaliśmy kolumienkę 3 ml dichlorometanu, który zbieraliśmy do fiolki. Należy uważać aby nie dopuścić do wysuszenia złoża. Następnie nanieśliśmy ekstrakt i --> płukaliśmy[Author:.] powoli 8ml dichlorometanu, cały czas zbierając ekstrakt do fiolki. Na tym etapie nie używamy próżni, gdyż ważne jest powolne oddziaływanie miedzi z ekstraktem.
Do usuwania siarki można także użyć rtęci lub srebra. Jednakże rtęć jest toksyczna,
a srebro drogie.
-->
Następnie[Author:.]
nastrzykujemy 2 µl roztworu do analizy zawartości WWA za pomocą układu GC-
-->
MS[Author:.]
.
W czasie ćwiczenia wykorzystywaliśmy kolumienki handlowe, ale także wykonaliśmy swoja kolumienkę, wykorzystując w tym celu szklaną wąską rurkę. Na dno włożyliśmy watę szklaną, a potem wsypaliśmy krzemionki.
Tu powinna być ostatnia tabela z Excela z sumarycznymi wynikami!!!! Gdzie jest dyskusja wyników!!!!!!
Mieliście napisać w cześci teoretycznej o IDMS! Gdzie to jest!!!!
Izolacja związków z grupy WWA i PCB z wody i osadów. Gdzie to jest!!!
Metody analizy ilościowej w GC?
Gdzie są odnośniki literaturowe do części teoretycznej??????
Proszę napisać część teoretyczną jeszcze raz, ze wszystkimi odnośnikami literaturowymi, opierając się na literaturze NAUKOWEJ a nie na wikipedii!!!!!
W gazowej tez?
Dodawaliśmy wzorzec dla PCB?
Tu odparowanie!
Wymywanie nie płukanie
Najpierw odparowywnie
Styl!!!