Kolokwium 2. Magdalena Pawełkiewicz 30.11.2010 r.

Transformacja - (definicja mikrobiologiczna wg Griffitha 1929) zmiana fenotypu organizmu przez wprowadzenie obcego DNA do jego genomu;

- zmiana genetycznych właściwości komórki (organizmu) spowodowana pobraniem DNA wyizolowanego z innej komórki i włączeniem go do aparatu genetycznego

Metody transformacji:

• bezwektorowe:

• - elektroporacja (transformacja protoplastów)

• - PEG (transformacja protoplastów)

• - mikrowstrzeliwanie

• - mikroinekcja

• - wytrząsanie zawiesiny komórek z włóknami szklanymi

• - wprowadzanie DNA zamkniętego w liposomach

• wektorowe:

• - Agrobacterium tumefaciens

• - Agrobacterium rhizogenes

Agrobacterium tumefaciens:

• Gramm (-), wolnożyjąca bakteria glebowa nalężąca do rodziny Rhizobiaceae

• Polifag

• Wywołuje chorobę określaną jako rak szyjki korzeniowej (crown gall disease)

• Infekuje rośliny dwuliścienne oraz kilka roślin jednoliściennych np. Asparagus officinalis, Z. mays, T. aestivum

• Plazmid Ti (tumor inducing plasmid) zawierający fragment T-DNA

Agrobacterium rhizogenes:

• Gramm (-), wolnożyjąca bakteria glebowa nalężąca do rodziny Rhizobiaceae

• Wywołuje chorobę przerostów korzeniowych - włośnikowatość

• Plazmid Ri (Rootinducing plasmid) zawierający fragment T-DNA

Plazmid Ti:

• Plazmid indukujący tumory (ang. Tumor inducing plasmid)

• Wlk. Ok. 200 kpz

• Występuje w komórce w małej liczbie kopi (1-2)

• Replikuje niezależnie od chromosomu bakteryjnego

• Może być przenoszony między komórkami Agrobacterium na drodze koniugacji

T-DNA:

• Obszar przenoszony do komórek roślinnych w postaci ssDNA

• Wyznaczony przez specyficzne 25 nukleotydowe sekwencje graniczne (RB-right border, LB-left border)

• Geny obszaru T-DNA nie ulegają ekspresji w komórkach Agrobacterium

W obszarze T-DNA znajdują się:

• Geny syntezy opin

• Geny syntezy hormonów roślinnych (auksyn i cytokinin)

Opiny - pochodne aminokwasów głównie argininy, żródło C i N dla bakterii; 3 klasy opin: -oktopina, - nopalina, -agropina

Onkogeny - geny syntezy fitohormonów:

• Auksyn

• IaaM (monooksygenaza tryptofanu)

• IaaH (hydrolaza indoloacetamidowa)

• Cytokinin

• ipt (transferaza izopentylowa)

Transfer T-DNA:

1. Przyczepienie się Agrobacterium do komórek roślinnych

- geny chromosomalne: chvA, chvB, pscA, att

Zranione komórki produkują związki fenolowe chemoatraktanty - np. Acetosyringon (stymulacja genów vir)

2. Przeniesienie T-DNA do komórki roślinnej

- geny wirulencji (vir; 24 geny zgrupowane w 8-u operonach: A, B, C, D, E, F, G, H)

Model przeniesienia i integracji T-DNA

• Nić T przenoszona jest w postaci kompleksu DNA-białko

• Białko na końcu 5' T-DNA wchodzi w interakcję z roślinnym DNA i nacina je

• Jednoniciowe T-DNA jest przyłączane do jednej nici DNA a powstałe napięcia rozrywają drugą nić

• Końce nici T ligowane z DNA i dosyntetyzowana jest 2 nić komplementarna do nici T

• Często dochodzi do rearanżacji w obszarze

Wprowadzenie DNA do komórki Agrobacterium

• Klonowanie i modyfikowanie DNA dokonuje się w plazmidach E.coli

• Plazmid ze skonstruowanym genem jest przenoszony do Agrobacterium za pomocą:

- koniugacji

- rekombinacji homologicznej

Konstrukcja integrowanego DNA

• Organizacja i orientacja sekwencji DNA (transgenu), która ma być wprowadzona do genomu roślinnego, zależy od tego jakich zmian oczekuje się w roślinie transgenicznej np.: nadekspresja, represja, tkankowo- swoista ekspresja, ekspresja regulowana warunkami środowiska

• Sekwencja DNA musi mieć odpowiednią organizację sekwencji kodującej i regulatorowej

• Konstrukcje zawierają fragmenty genów różnych organizmów i tworzy się je poprzez cięcie specyficznymi enzymami restrykcyjnymi i ligację

Budowa konstrukcji genomowej

• Promotory - sekwencje DNA nieodczytywane, sygnalizujące gdzie trzeba zacząc odczytywanie kodu DNA. Do nich przyłącza się bardzo ważne białko enzymatyczne - polimeraza RNA. To właśnie ono dokonuje syntezy mRNA. Konstytutywne, tkankowo specyficzne, indukowane: chemiczne określonymi warunkami środowiskowymi

• Terminatory - sekwencje DNA nieodczytywane, które dają znak polimerazie RNA w którym miejscu ma zakończyć transkrypcję

Agrobacterium tumefaciens - narzędzie inżynierii genetycznej

Opracowano metody wprowadzenia dowolnego genu do obszaru T-DNA A.tumefaciens, tak aby gen został wprowadzony do komórek roślinnych.

Aby obce geny wprowadzić do obszaru T-DNA należało przekonstruować plazmid Ti.

Analiza procesu integracji T-DNA i wiele innych eksperymentów pozwoliły ostatecznie opracować konstrukcję dwóch wektorów:

• Kointergarcyjnego - sekwencje wprowadzane do genomu roślin są na samym plazmidzie co geny vir (czyli jest to plazmid Ti po rekombinacji z plazmidem pośrednim)

• Binarnego - sekwencje wprowadzane genomu roślin i geny vir są na różnych plazmidach (A.tumefaciens posiada rozbrojony plazmid Ti z obszarem wirulencji i plazmid binarny z obszarem T-DNA)

Przygotowanie pożywek

Dla bakterii

Dla roślin

• Regeneracyjne

• Selekcyjne z antybiotykami

• Antybiotyki są wrażliwe na wysoką temperaturę i dodajemy je do pożywki po sterylizacji - antybiotyki sterylizuje się przez filtrowanie

Otrzymanie roślin do transformacji

• Sterylizacja i wysiew nasion

- dla każdego materiału roślinnego należy dobrać najbardziej właściwe warunki sterylizacji rodzaj, stężenie, czas działania subst sterylizującej. Kompromis: sterylność a uszkodzenie

• Podchloryn - w celu zapewnienia lepszej penetracji czynnika sterylizującego:

- moczenie w alkoholu etylowym; dodanie detergentu

Kiełkowanie

• Nasiona po sterylizacji są umieszczane w płytkach Petriego lub słoikach na pożywkach umożliwiających ukorzenienie się tych roślin

• Wzrost siewek i roślin w kontrolowanych warunkach w fitotronie

Prekultura (kondycjonowanie)

• Kompetencjędo regeneracji i transformacji można zwiększyć w wyniku prekultury na pożywkach.

• Przez co stres spowodowany uszkodzeniem tkanek nie nakłada się na stres wynikający z kokultury.

• Nie zawsze jest korzystne.

Cięcie eksplantatów

• Eksplantaty = materiał roślinny, z którego inicjowana jest kultura.

• Najczęściej są to fragmenty jakiegoś organu.

• Eksplantaty są pobierane z liści i fragmentowane na kawałki o wielkości ok. 5x5 mm.

• Cięcie może odbywać się na szalce w cienkiej warstwie pożywki MS.

Przygotowanie Agrobacterium

• Przeprowadzamy pasaż na płytkach z pożywką YEB i prowadzimy hodowlę w 28oC.

• Po 2 dniach zakładamy płynną kulturę bakterii.

• Wirujemy bakterie.

• Osad bakterii rozpuszczamy w pożywce do inokulacji, którą zalejemy przygotowane i pocięte eksplantaty.

• Inokulum z bakteriami musi mieć odpowiednią gęstość.

Inokulacja - kokultura

• Eksplantaty zalewa się przygotowaną pożywką z bakteriami.

• Czas i zagęszczenie?

• Do zranionych krawędzi „przyczepia” się Agrobacterium i następuje transfer T-DNA do możliwie dużej liczby komórek.

• Im dłuższy czas kokultury tym trudniej wyeliminować bakterie i dłużej trwa stres rośliny.

• Inokulacja i kokultura wzmacniają procesy stresowe eksplantatu.

Elimanacja Agrobacterium

• Po stresie kokultury bakterie powinny zostać jak najszybciej wyeleminowane (potencjał regeneracyjny).

• Stosuje się płukanie eksplantatów w antybiotyku i dodawanie go do pożywki regeneracyjnej.

• Skuteczne stężenia antybiotyków nie są neutralne dla tkanek roślinnych.

• Mimo podawania antybiotyków w kolejnych pasażach, bakterie mogą przetrwać przez cały okres kultury.

Wykładanie eksplantatów na pożywki regeneracyjne i selekcyjne

• Stosowanie czynnika selekcyjnego zaraz po zakończeniu kokultury może zahamować regenerację.

• Selekcja powinna:

- wyeliminować lub osłabić komórki, które nie uległy transformacji

- komórki transgeniczne mają aktywne geny

• I nie powinny negatywnie reagować na antybiotyk ,

• Wybór strategii selekcji zależy od promotora i genu markerowego, reakcji tkanek i sposobu regeneracji.

Regeneracja roślin

• Po 2-3 tygodniach pojawia się kalus na eksplantatach w miejscu zranienia

• Po 6 tygodniach pojawiają się pędy, które są odcinane od kalusa

Ukorzenianie

• Po zregenerowaniu pędów rośliny są gotowe do ukorzeniania i przekłada się je na pożywki do ukorzeniania po 9 tygodniach

Rośliny transgeniczne

• W pełni zregenerowane rośliny, które wyrosły na pożywkach selekcyjnych

• Otrzymuje się je po ok. 12 tygodniach

Z pożywki do ziemi

• Ukorzenia się rośliny po selekcji przenosi się do doniczek z ziemią

• Ok. 13 tygodnia

Efektywność transformacji - wyrażana jest najczęściej procentem eksplantatów, z których zregenerowano transgeniczny pęd

Czynniki wpływające na efektywność transformacji (można podzielić na związane z):

• Rośliną - gatunek, genotyp, eksplantat, pożywki regeneracyjne, zmienność somaklonalna układu regeneracyjnego

• Agrobacterium - szczep (geny wirulencji: pAL4404 i pSB131), stabilność konstrukcji genowej, przygotowanie Agrobacterium (acetosyringon, gęstość, pożywka)

• Interakcją Agrobacterium - roślina - reakcja na stres zranienia i stres spowodowany przez inokulację, reakcja na antybiotyki, kompetencja komórek do transformacji

Transformacja - wprowadzenie pożądanych cech dzięki wprowadzeniu jednego lub kilku genów

Transfer genów do roślin uprawnych:

• Stosunkowo precyzyjny i przewidywalny

• Zmiany są subtelne

• Pozwala na dowolność sterowania

• Korzystne cechy

Otrzymanie roślin transgenicznych jest możliwe tylko w przypadku integracji transgenu z genomem takiej komórki, która posiada lub nabierze kompetencji do regeneracji.

Wysoka kompetencja do transformacji nie jest równoznaczna z wysoką kompetencją do regeneracji i odwrotnie (wiek, organy, genotyp).

Korzystnie jest używać eksplantatów z kultur in-vitro.

Cechy rośliny transgenicznej (Potrykus 1990):

• Transgen trwale zintegrowany z genomem

• Jedna kopia transgenu

• Ulega poprawnej ekspresji

• Dziedziczy się w sposób mendlowski

Jak się robi GMO - wykorzystanie naturalnego sposobu transformacji - wprowadzania genów (konstrukcji genowych) przez Agrobacterium tumefaciens, wywołującą raka bakteryjnego.

Jak sprawić żeby odtwarzane rośliny powstawały wyłącznie z transformowanych komórek?\

• Wprowadzenie odpowiednich genów:

- odporności na różne substancje chemiczne

- dających łatwo zauważalny i jednoznaczny efekt

• Testowanie otrzymywanych roślin

Dlaczego używa się genów markerowych podczas transformacji roślin?

• Wyselekcjonowanie transgenicznych komórek/roślin - marker selekcyjny

• Wizualizacja ekspresji transgenu geny reporterowe.

• Określenie ilościowe poziomu ekspresji genów

Markery selekcyjne

• Markery nadające zdolność do przeżycia w warunkach selekcyjnych

- odporność na sntybiotyki

- odporność na herbicydy

- odporność na fitotoksyny

• Markery letalne

- np. selekcja mutantów supresorów ekspresji genu

Geny reporterowe - pozwalają na wizualizację ekspresji genu

• Histologiczne - pozwalają określić fenotyp na potraktowaniu substratem lub podczas obserwacji w specjalnych warunkach

• Morfologiczne - zmiany w morfologii roślin np. brak włosków

• Związane z pigmentacją - związane z produkcją antocjanów

oznaczenie ilościowe poziomu produktu genu:

• Acetylotransferaza chloramfenikolu CAT

• B-D-glukuronidaza GUS

• Lucyferaza luc, luxA/B

• Fosfotransferaza neomycyny NPTII

Odporność na antybiotyki
Marker selekcyjny	Czynnik selekcyjny	Mechanizm działania	Pochodzenie
Fosfotransferaza neomycyny (npt)	Kanamycyna Genetycyna /G418 (inhibicja translacji)	Detoksyfikacja czynnika selekcyjnego	E.coli
Fosfotransferaza higromycyny (hpt)	Higromycyna B (inhibicja translacji)	Detoksyfikacja czynnika selekcyjnego	E.coli
Tolerancja na herbicydy
Syntaza glutaminowa (GS)	Dialafos, Glufosinat (prekursory BASTY) (inhibicja syntazy glutaminowej)	Nadprodukcja zmutowanego białka (niewrażliwego)	Medicago sativo
Acetylotransferaza fosfinotriciny (bar, PAT)	Fosfinotricina BASTA (jak wyżej)	Detoksyfikacja	Streptomyces hygroscopicus
Syntaza EPSPS (aroA)	Glyfosat ROUNDUP (inhibicja syntazy EPSPS)	Nadprodukcja zmutowanego białka (niewrażliwego) w chloroplastach	Arabidopsis thallana, Escherichia coli, Petunia hybrida, Salmonella typhimurium
Najpowszechniej używane geny reporterowe
Nazwa	Substrat pozwalający na wizualizację	Fenotyp	Pochodzenie
B-D-glukuronidaza gus, uidA	X-glue	zabarwienie w kolorze indygo	E.coli
Białko zielonej fluoroscencji gfp5-ER	światło: 395 lub 465 nm	zielona fluoroscencja 509 nm	Meduza

Charakterystyka roślin transgenicznych:

1. PCR: eliminacja pędów nie posiadających insertu

2. Southern - blot: stwierdzenie poprawności integracji i liczby kopii transgenu, przypadki wprowadzenia od 1 do 6 kopii transgenu, lokalizacja w genomie jest losowa

3. Northern - blot: analiza ekspresji transgenu na poziomie mRNA

4. Western - blot lub test ELISA: gdy wprowadzony gen determinuje powstawanie białka

Integracja transgenów w genomie roślinnym

• Do komórki roślinnej może przykleić się do 200 komórek Agrobacterium - zwykle jedna bakteria wytwarza jeden kompleks T-DNA

• Genom roślinny - jest złożony (zróżnicowany) zmienia swą strukturę zależnie od fazy cyklu życiowego komórki (pętle i matrix)

• Na poziomie chromatyny

• Heterochromatyna

• Euchromatyna

• Na poziomie chromosomu

• Obszary telomerowe i centromer

• Obszary sekwencji powtórzonych

• Obszary zawierające geny sekwencji MAR

• Miejsce integracji T-DNA w genomie jest losowe (AT)

• Może dochodzić do rearanżacji w obszarze T-DNA podczas lub po integracji

• Agrobacterium - precyzyjne wycięcie ściśle zdefiniowanego obszaru T-DNA, ale

• Dokładne wycięcie T-DNA w pobliżu prawej sekwencji granicznej mniej dokładne a czasami brak przecięcia nici T-DNA w pobliżu lewej sekwencji granicznej

Tak więc:

Są przykłady zintegrowania całego plazmidu Ti w genomie roślinnym lub fragmentów różnice w precyzji wycinania T-DNA pomiędzy szczepami.

Rośliny transgeniczne na rynku

Rośliny z genem Bt są chronione przed atakiem owadów, zmniejszają zużycie pestycydów. Rośliny wytwarzają białka toksyczne dla niektórych owadów.
Kukurydza, bawełna, ziemniaki
plany: słonecznik, soja, rzepak, pszenica, pomidory

Rośliny tolerancyjne na herbicydy, rolnicy mogą stosować specyficzne herbicydy do walki z chwastami, bez uszkodzenia uprawy.
Soja, bawełna, kukurydza, rzepak, ryż
plany: pszenica, buraki cukrowe

Rośliny odporne na choroby, uzbrojone do walki z chorobami wirusowymi.
Słodkie ziemniaki, maniok, ryż, kukurydza, dynia, papaja
plany: pomidory, banany

Oleje spożywcze, redukcja obróbki przed sprzedażą, zdrowsza żywność.
słonecznik, orzeszki ziemne, soja

Opóźnione dojrzewanie owoców i warzyw i zwiększenie zawartości części stałych do produkcji past i sosów. Pomidory - lepszy smak, kolor, lepsze do transportu, dłuższa świeżość.
plany: porzeczki, truskawki, wiśnie, banany, ananasy

Ulepszona żywność o podwyższonym poziomie związków mineralnych, witamin, antyoksydantów i innych związkach pochodzenia roślinnego. Walka z głodem krajów rozwijających się, chorobami i zdrowa żywność.

Grupy roślin uprawnych, u których wartość linii/odmian transgenicznych sprawdzono w warunkach polowych (OECD Product Database)

• Rośliny warzywne - cebula, szparagi, kapusta, brokuły, papryka, cykoria, arbuz, melon, ogórek, cukinia, marchew, bataty, sałata, pomidor, oberżyna

• Motylkowe - soja, łubin, lucerna, groch

• Rośliny sadownicze - kiwi, papaja, kasztanowiec, truskawka, orzech włoski, jabłoń, śliwa, winorośl, żurawina

• Rośliny oleiste - orzech ziemny, gorczyca, rzepik, rzepak, słonecznik, gorczyca biała

• Rośliny zbożowe - jęczmień, ryż, kukurydza, pszenica

• Rośliny ozdobne - goździk, mieczyk, pelargonia, róża

• Drzewa leśne i ozdobne - świerk, sosna, topola, brzoza, eukaliptus

• Inne - burak cukrowy, bawełna, len, tytoń, trzcina cukrowa, ziemniak

Korzyści płynące z biotechnologii:

• Dostarczanie właściwych mikroelementów - np. ryż o większej zawartości wit. A, żelaza aby zwiększyć zawartość wit. E w oleju roślinnym

• Pomoc w ochronie przeciw chorobom człowieka - np. soja i rzepak o zwiększonej zawartości zdrowszych nienasyconych tłuszczy, ziemniaki o zwiększonej zawartości skrobi

• Redukcja toksyn - np. kukurydza odporna na owady ma mniejszy poziom mykotoksyn w kolbach

• Jadalne szczepionki - np. ziemniaki zawierające szczepionkę przeciwko wirusowi żółtaczki B

• Redukcja alergenów w pożywieniu - np. rozwinięcie technik pozwalających na identyfikację i neutralizację czynników alergennych w materiale genetycznym ryżu, pszenicy, orzeszków ziemnych i innych pokarmach

• Zmniejszenie alergii nie związanych z jedzeniem - np. zmodyfikowanie rośliny produkującej latex, który powoduje alergie a dodatkowo potania to koszty z porównaniu z tradycyjną metodą produkcji (brazylijskie drzewa kauczukowe)

Biotechnologia a globalne rolnictwo - korzyści!

• Czynnik środowiskowy - zmniejszenie zużycia pestycydów

• Zmniejszenie strat powodowanych przez choroby i szkodniki

• Poprawa jakości produktów

• Nowe produkty

• Poprawa produktywności

• Jakość po zbiorach - wydłużone przechowywanie owoców, warzyw i kwiatów

• Zwiększona liczba odmian (czasu ich uprawy)

• Tolerancja na stresy - susza, zakwaszenie, zasolenie, wysoka temp.

• Bardziej wartościowa żywność i zdrowa żywność - mniej toksyn

• Białka dla przemysłu farmaceutycznego

Biotechnologia - ćwiczenia 2010/2011

12

---