Wykład 1

Wprowadzenie do instrumentalnych metod analitycznych

Etapy procesu analitycznego

A - pobieranie próbki

B - przygotowanie próbki do analizy

C - pomiar

D - obróbka wyników

E - informacja analityczna i wnioski

Pobieranie próbek do analizy ilościowej

Próbka reprezentatywna = porcja materiału pobrana z badanego obiektu i wyselekcjonowana w taki sposób, że wykazuje istotne właściwości charakterystyczne dla całego układu

Pobieranie próbek, ich transport i przechowywanie winny być przeprowadzone tak aby zapobiec:

• zanieczyszczeniu próbki

• utracie lotnych składników próbki

• reakcjom ze składnikami powietrza (O₂, CO₂, H₂O)

• rozkładowi próbki pod wpływem promieniowania uV

• degradacji próbki

• zmianom wywołanym efektem katalitycznym

Procedura pobierania próbek

badany obiekt

próbka pierwotna

próbka laboratoryjna

próbka próbka próbka

analityczna analityczna analityczna

postępowanie postępowanie postępowanie

analityczne analityczne analityczne

Przygotowanie próbek do analizy (1)

1. Metody, w których próbka powinna być w postaci roztworu:

• grawimetria

• miareczkowanie

• spektrofotometria uV-VIS

• spektrofluorymetria

• fotometria płomieniowa

• emisyjna spektrometria atomowa ze wzbudzeniem plazmowym

• absorpcyjna spektrometria atomowa

• potencjometria

• polarografia i metody woltamperometryczne

• elektrograwimetria i kulometria

• konduktometria

2. Metody, w których próbka może być w postaci stałej lub w roztworze:

• spektrofotometria IR

• analiza aktywacyjna

• spektroskopia fluorescencji rentgenowskiej

• spektrometria mas

• spektrometria magnetycznego rezonansu jądrowego

Przygotowanie próbek do analizy (2)

1. Przeprowadzenie próbek do roztworu

2. Wydzielanie, rozdzielanie i zatężanie analitu

3. Maskowanie czynników zakłócających pomiar

4. Derywatyzację analitu

Ad 1. Przeprowadzenie próbek do roztworu

• rozpuszczanie - gdy energia solwatacji przewyższa energię sieci krystalicznej

- związki jonowe w H₂O

- niepolarne związki organiczne w

niepolarnych rozpuszczalnikach

organicznych

! Rozpuszczalnik musi charakteryzować się dużą czystością!

• roztwarzanie - dotyczy substancji, które nie rozpuszczają się w rozpuszczalnikach, bądź rozpuszczaja się jedynie w sposób ograniczony (metale, stopy, minerały, szkła, gleba, materiały biologiczne). Proces ten zachodzi z udziałem reakcji chemicznych (efektem jest rozkład próbki)

Roztwarzanie:

• Próbek nieorganicznych

- z użyciem rocieńczonych kwasów

- z użyciem stężonych kwasów

- przez stapianie z różnymi topnikami

• Próbek organicznych i materiałów biologicznych

- spalanie w piecach do analizy elementarnej (C, H, N)

- spalanie w butlach z tlenem wobec katalizatorów (S, P)

- spalanie techniką suchą w piecach termicznych (pierwiastki nielotne, najczęściej metale)

- spalanie na mokro wobec kwasów utleniających np. mieszanin H₂SO₄+HNO₃ lub HNO₃+HClO₄ (metale)

- stapianie z nadtlenkiem sodu (niemetale)

- stapianie z sodem (halogenki)

Matryca analityczna

Układ: substancja badana + substancje towarzyszące = matryca analityczna substancji badanej

Próbki biologiczne:

• krew pełna

• osocze i surowica

• mocz

Ad 2. Wydzielanie, rozdzielanie i zatężanie analitu (oddzielanie od matrycy):

- ekstrakcja w układzie ciecz-ciecz i ciecz-ciało stałe

- strącanie i współstrącanie

- krystalizacja

- elektroosadzanie

- adsorpcja (wiązanie na powierzchni lub na granicy faz)

- absorpcja (wnikanie do wnętrza fazy)

- wymiana jonowa

- chromatografia

- odparowanie i destylacja

- filtracja i ultrafiltracja

- dializa

- wirowanie i ultrawirowanie

- elektroforeza

Pomiar analityczny

Metody pomiaru analitycznego można podzielić na:

• fizyczne i chemiczne

• klasyczne i instrumentalne

• bezwzględne (absolutne) i porównawcze (względne)

Wybrane zjawiska fizyczne wykorzystywane w metodach instrumentalnych:

• odbicie światła

• załamanie światła

• skręcenie płaszczyzny światła spolaryzowanego

• absorpcja i emisja promieniowania elektromagnetycznego

• rozproszenie promieniowania

Wybrane zjawiska fizykochemiczne stosowane w analizie instrumentalnej

• wydzielanie elektrolityczne

• przepływ prądu między elektrodami

• zmiana potencjału elektrodowego

• przewodnictwo elektryczne roztworów

Metody analityczne

• analiza klasyczna - metody wagowe i objętościowe oparte na właściwościach chemicznych analizowanych substancji

• analiza instrumentalna - metody wykorzystujące zjawiska fizyczne i fizykochemiczne. Do ich wykonania potrzebna jest odpowiednia aparatura

Metody klasyczne Metody instrumentalne

• czułość 10^-1 - 10^-2 % < 10^-5 %

• szybkość mała na ogół duża

• dokładność większa mniejsza

• precyzja większa mniejsza

• bezwzględne tak nie

• automatyzacja nie tak

Metody bezwzględne - nie wymagające wzorcowania i z reguły oparte na reakcjach chemicznych przebiegających całkowicie i zgodnie ze znaną stechiometrią. Są to:

• grawimetria - pomiar masy produktów reakcji strącania (ważenie)

• miareczkowanie - pomiar objętości titranta

• gazometria - pomiar objętości gazu

• kulometria - pomiar wielkości ładunku

• elektrograwimetria - pomiar masy substancji wydzielonej na elektrodzie (ważenie)

• termograwimetria - pomiar ubytku masy (ważenie)

Metody porównawcze (względne) - wymagają kalibracji względem znanych wzorców. Do metod porównawczych należy większość metod instrumentalnych. Porównanie z wzorcami może być wykonane różnymi metodami:

• metodą krzywej kalibracyjnej (seria wzorców zewnętrznych)

• metodą dodawania wzorca (substancję oznaczaną)

• metodą wzorca wewnętrznego (substancję nie będącą analitem)

Kryteria wyboru metody analitycznej

• wymagana precyzja i czułość oznaczeń

• czułość i zakres oznaczalności metody

• wielkość próbki

• selektywność i specyficzność oznaczeń

• stan skupienia próbki

• możliwość rozkładu lub niszczenia próbki

• liczba oznaczeń

• czas wykonywania analizy

• koszt analizy

Kryteria oceny metod analitycznych

• dokładność metody

• precyzja

• czułość

• oznaczalność / wykrywalność

• specyficzność

Metoda jest dokładna jeżeli wartość mierzonej wielkości są bliskie wartości rzeczywistej

Metoda precyzyjna charakteryzuje się małym rozrzutem wartości przy wielokrotnych powtórzeniach pomiaru

Czułość metody określa wielkość różnic pomiędzy stężeniami oznaczanych związków, które można wykryć za pomocą danej metody

Granica wykrywalności (limit detekcji) - określa najmniejszą wartość danej wielkości (np. najmniejsze stężenie), jaką można wykryć daną metodą

Specyficzność metody (selektywność) - możliwość oznaczania daną metodą jednej substancji niezależnie od obecności w próbie innych substancji.

Podział instrumentalnych metod analitycznych

1. Metody optyczne - związane ze sprężystym oddziaływaniem promieniowania elektromagnetycznego na próbkę

2. Metody spektroskopowe - związane z niesprężystym oddziaływaniem promieniowania elektromagnetycznego na próbkę

3. Metody elektroanalityczne - związane z efektami towarzyszącymi przepływowi prądu elektrycznego przez badany roztwór lub spowodowane reakcjami zachodzącymi na elektrodach zanurzonych w badanym roztworze

4. Metody rozdzielcze - polegające na przeprowadzeniu oznaczanego składnika mieszaniny lub substancji przeszkadzających do innej fazy

5. Metody radiometryczne - związane z efektami naturalnej lub sztucznej promieniotwórczości oraz efektami współdziałania promieniowania jądrowego z badaną próbką

Metody optyczne

Istotą metod optycznych są oddziaływania sprężyste promieniowania elektromagnetycznego z materią, w czasie których nie zachodzą zmiany ilości energii promieniowania, a jedynie zmiany jego kierunku. Są to:

• refraktometria

• interferometria

• polarymetria

• nefelometria

• turbidymetria

• mikroskopia optyczna

Refraktometria

Podstawy teoretyczne

n₂₁ - względny współczynnik załamania (współczynnik refrakcji)

b_g - kąt graniczny, jest to kąt padania, dla którego kąt załamania wynosi 90 stopni (zał. Światło przechodzi z ośrodka optycznie gęstszego do rzadszego)

n₂₁= sin /sin  = sin agr

Pomiar kąta granicznego umożliwia wyznaczenie współczynnika załamania promienia światła o danej długości fali.

Wielkość współczynnika n₂₁ zależy od:

1. Długości fali

• krótsze fale są załamywane silniej = współczynnik załamania światła ma większe wartości dla fal krótkich

Dyspersja światła (rozszczepienie światła) jest to zmiana współczynnika załamania światła tego samego ośrodka, wynikająca ze zmian długości fali

• do pomiarów najczęściej stosuje się światło monochromatyczne (np. linii D lampy sodowej, l = 589,3 nm)

2. Temperatury - dla większości cieczy organicznych współczynniki temperaturowe są ujemne => wzrost temperatury powoduje zmniejszenie współczynnika załamania światła (3,5-5,5•10^-4 na 1K) n_D²⁰

3. Ciśnienia - w bardzo niewielkim stopniu wpływa na współczynniki załamania światła cieczy i substancji stałych (ok. 3,0•10^-5 na 1013 hPa). Wpływ ciśnienia w przypadku gazów jest znacznie większy.

3. Stężenia substancji badanej - współczynnika załamania substancji ciekłych zmienia się wraz ze zmianą stężenia. Zależność:

n = f(c)

dla niektórych substancji ma charakter prostoliniowy (np. białka surowicy krwi, alkoholu etylowego)

UWAGA! Jest to metoda pozwalająca uzyskać jedynie orientacyjne wyniki i nie należy jej stosować do oznaczeń wymagających większej dokładności! Zalety metody: szybkość, łatwość wykonania, ilość używanej surowicy

Refraktometria - bada zależności pomiędzy wielkością współczynnika załamania światła i

• strukturą związków chemicznych (analiza jakościowa)

• stężeniem substancji (analiza ilościowa)

Analiza jakościowa

Refrakcja molowa R_M (określona wzorem H.A. Lorentza i R. Lorentza):

n²-1 M

R_M = [R_M ] = [m³ mol^-1]

n²-1 d

n - współczynnik załamania światła danej substancji

M - masa molowa

d - gęstość

• wiąże się z polaryzacją elektronową w cząsteczce występującą podczas przechodzenia światła

• jest wielkością charakterystyczną i stałą dla danego związku chemicznego

• zależy od długości stosowanego światła

• jest sumą refrakcji atomów i wiązań występujących w cząsteczce (= ma charakter addytywny)

• R_M zmierzona (pomiar n, d) = R_M obliczona teoretycznie - potwierdza zgodność z danym wzorem strukturalnym

R_M = R_atomów + R_wiązań

Wartości refrakcji atomowych [cm³ mol^-1] i wiązań dla linii D światła sodowego:

• C 2,418

• H 1,100

• O (w grupie karbonylowej) 2,211

• O (w eterach) 1,643

• O (w grupie hydroksylowej) 1,525

• N (w aminie I-rzędowej) 2,322

• N (w aminie II-rzędowej) 2,502

• N (w aminie III-rzędowej) 2,840

• wiązanie podwójne 1,733

• pierścień czteroczłonowy 0,48

R_roztw = x₁R₁ + x₂R₂

R_roztw - refrakcja molowa roztworu

x₁, x₂ - ułamki molowe składników roztworu

R₁, R₂ - refrakcje molowe składników roztworu

n²_roztw - 1 x₁M₁ + x₂M₂

R_roztw =

n²_roztw+2 d_roztw

R_roztw - refrakcja molowa roztworu

x₁, x₂ - ułamki molowe składników roztworu

M₁, M₂ - masy molowe składników roztworu

d_roztw - gęstość roztworu

Współczynniki załamania światła - pomiary za pomocą:

• refraktometrów - dokładność 1•10^-4

• pomiar współczynnika załamania światła cieczy i ciał stałych

• w świetle przechodzącym i odbitym

• interferometrów - dokładność 3•10^-8

• porównują szybkość rozchodzenia się światła w ośrodku badanym i wzorcowym wykorzystując zjawisko interferencji

• stosowane do oznaczania bardzo małych współczynników załamania światła (gazy)

Schemat refraktometru Abbego

Polarymetria

Polaryzacja światła = uporządkowanie drgań fali elektromagnetycznej w jednej płaszczyźnie względem kierunku jej ruchu.

Sposoby uzyskania światła spolaryzowanego:

1. Zjawisko odbicia światła od gładkiej powierzchni dielektryków przezroczystych - dla pewnego kąta padania (tzw. kąt Brewstera), promień odbity i promień załamany są prostopadłe. Promień odbity jest całkowicie spolaryzowany liniowo

2. Przejście światła przez kryształy posiadające zdolność podwójnego załamania - ośrodki anizotropowe (szpat islandzki; kalcyt CaCO₃). Promień światła rozdziela się na całkowicie spolaryzowane promienie zwyczajny i nadzwyczajny (drgają w płaszczyznach do siebie prostopadłych)

3. Zjawisko dichroizmu w kryształach dichroicznych (polaroidach) - polega na niejednakowym pochłanianiu promienia zwyczajnego i nadzwyczajnego. Kryształy dichroiczne (np. turmalin) pochłaniają silnie jeden z promieni np. zwyczajny

Nikol

• specjalnie oszlifowany szpat islandzki, przecięty wzdłuż przekątnej

• obydwie połówki sklejone są balsamem kanadyjskim o współczynniku załamania dla światła sodowego n=1,54

• promień padający ulega rozszczepieniu na promienie zwyczajny i nadzwyczajny

• promień zwyczajny ulega całkowitemu wewnętrznemu odbiciu na granicy szpatu z balsamem

• przez drugą część pryzmatu przechodzi tylko promień nadzwyczajny

• jeżeli na nikol pada wiązka światła spolaryzowanego liniowo to przechodzi ona bez przeszkód tylko wtedy gdy płaszczyzna przecięcia nikola jest równoległa do płaszczyzny drgań wektora świetlnego

Czynność optyczna

Ciała stałe i ciekłe skręcające płaszczyznę światła spolaryzowanego liniowo nazywamy czynnymi optycznie. W zależności od kierunku skręcania płaszczyzny światła spolaryzowanego dzielimy je na:

(+) prawoskrętne

(-) lewoskrętne

Wielkość kąta skręcania zależy od:

• rodzaju substancji i jej stężenia (c)

• grubości warstwy (l)

• temperatury (T)

• długości fali użytego światła (l)

 = k c l

Zwykle pomiary dokonuje się w temperaturze 293 K za pomocą linii D światła sodowego - w tych warunkach współczynnik k nosi nazwę skręcalności właściwej

Skręcalność właściwa []_D²⁹³



[]_D²⁹³ =

l c

a - kąt skręcania próbki danej substancji optycznie czynnej

l - dla ciał stałych 1 mm, dla cieczy 1 dm

c - stężenie substancji optycznie czynnej [1 g/cm³]

 100

[_D²⁹³ =

l c

c - stężenie w [g/100 cm³]

 100

c =

l []_D²⁹³

Polarymetr - zasadą jego działania jest użycie dwóch nikoli lub polaroidów:

• polaryzatora - polaryzującego wiązkę świetlną

• analizatora - ustalenie płaszczyzny polaryzacji po przejściu światła przez substancję optycznie czynną

Nefelometria i turbidymetria

Porównanie zasady pomiaru nefelometrycznego i turbidymetrycznego (opartych na zjawisku rozpraszania światła w roztworach koloidalnych i zawiesinach).

Metody nefelometryczne - pomiar natężenia światła rozproszonego przez roztwór koloidalny lub zawiesinę

Metody turbidymetryczne - pomiar natężenia światła przechodzącego przez roztwór koloidalny lub przez zawiesinę

NEFELOMETRIA

I_n - natężenie światła rozproszonego zależy od:

• stężenia roztworu badanego

• wielkości cząstek

Nv²

I_n=I₀ F (1+cos²)

⁴ r²

I₀ - natężenie promieniowania padającego

N - liczba cząstek rozpraszających

v - objętość cząstki

r - odległość detektora

F - współczynnik proporcjonalności (zależny od współczynnika załamania światła przez fazę rozproszoną i rozpraszającą)

 długość fali promieniowania padającego

 - kąt między wiązką promieniowania padającego i rozproszonego

Po uwzględnieniu wartości stałych w warunkach pomiaru:

I_n = I₀ N K = I₀ K c

K - wartość stała

c - stężenie substancji

Pomiar - przez porównanie natężenia światła rozproszonego przechodzącego przez roztwór badany (I_n,x) i przez wzorzec (I_n,w):

I_n,x c_x

=

I_n,w c_w

Na wartość natężenia promieniowania rozproszonego mają wpływ:

• temperatura

• pH

• skład roztworu

• sposób i kolejność dodawania odczynników

• czas jaki upływa od momentu wprowadzenia odczynników

• stężenie substancji tworzącej układ koloidalny

• obecność substancji zanieczyszczających

Metody pomiarowe stosowane w nefelometrii:

1. Metoda porównania z serią wzorców

• Skala McFarlanda - wzorce zmętnienia

stosowane w bakteriologii (nefelometria wizualna)

2. Metoda na podstawie zmiany grubości warstwy roztworu (nefelometria wizualna)

3. Metoda pomiaru fotometrycznego - w nefelometrach fotoelektrycznych

TURBIDYMETRIA

S = turbidancja

I₀ l c d³

S = log = k = K l c

I_t d⁴+ ⁴

I₀ - natężenie światła padającego

I_t - natężenie światła po przejściu przez roztwór koloidalny/zawiesinę

l - grubość warstwy

c - stężenie roztworu koloidalnego/zawiesiny

d - średnica cząstek

 - długość fali światła padającego

k - współczynnik zależny od rodzaju zawiesiny i metody pomiaru

 - współczynnik zależny od metody pomiaru

K - stała uwzględniająca wszystkie współczynniki w danych warunkach

Pomiary ilościowe:

• przez porównanie turbidancji roztworu badanego (S_x) i wzorca (S_w) (przygotowanych i mierzonych) w tych samych warunkach:

S_x c_x

=

S_w c_w

• metoda krzywej kalibracyjnej (wzorcowej)

Aparatura stosowana w turbidymetrii:

• spektrofotometry

• kolorymetry

Zastosowanie metod optycznych w diagnostyce:

Refraktometria

• oznaczanie stężenia białka całkowitego w surowicy krwi

• oznaczanie gęstości

Polarymetria

• oznaczanie stężenia glukozy w moczu

Nefelometria

• bakteriologia - wzorce zmętnienia

• oznaczenia białek surowicy krwi (CRP)

Turbidymetria

• oznaczanie białek surowicy krwi (CRP, IgG, IgA, IgM)

MIKROSKOP ŚWIETLNY

Przebieg promieni świetlnych i powstawanie obrazu w mikroskopie świetlnym

1. Powstający obraz jest pozorny, odwrócony i powiększony

2. Powiększenie całkowite mikroskopu = iloczyn powiększenia obiektywu, okularu (i pośredniego układu optycznego): od 10 do 1500 x

3. Zdolność rozdzielcza mikroskopu (d) = najmniejsza odległość pomiędzy dwoma punktami, które są dostrzegalne w obrazie mikroskopowym oddzielnie

0,61 

d =

A

 - długość fali tworzącej obraz

A - apertura numeryczna obiektywu mikroskopu

A = n sin 

n - współczynnik załamania fali tworzącej obraz (zależny od środowiska zawartego pomiędzy preparatem a soczewką obiektywu np. szkło/powietrze): 1 lub 1,56 (olejek imersyjny)

 - kąt pomiędzy osią optyczną obiektywu a najbardziej skrajnym promieniem wpadającym do jego soczewki czołowej : 75-85°

Specjalne odmiany mikroskopów świetlnych:

1. Ciemne pole - promienie świetlne przechodzą przez preparat pod bardzo ostrym kątem. Do obiektywu docierają promienie ugięte i odbite od znajdujących się w preparacie cząstek

2. Mikroskop kontrastowo - fazowy - z układem optycznym zmieniającym przesunięcie fazy fali świetlnej na zmianę amplitudy, która jest odbierana przez oko ludzkie jako stopień jasności

3. Mikroskop polaryzacyjny - wykorzystujący różnice pomiędzy strukturami komórkowymi pod względem ich wpływu na polaryzację przechodzącego przez nie światła (obiekty izotropowe i anizotropowe)

4. Mikroskop fluorescencyjny - emisja światła widzialnego pod wpływem naświetlania substancji promieniami ultrafioletowymi (porfiryny, witamina A, chlorofil, fluorochromy stosowane w diagnostyce histochemicznej). Obraz: na ciemnym tle uwidaczniają się świecące struktury komórkowe i tkankowe.

5. Współogniskowy (konfokalny) skaningowy mikroskop świetlny

• przepuszcza promienie świetlne wyłącznie z płaszczyzny formowania obrazu, eliminując światło pochodzące z leżących poza nią warstw preparatu

• źródłem światła jest laser

• układ oświetlenia preparatu i układ tworzący obraz mają wspólną ogniskową

• zsynchronizowana zmiana położenia obu ognisk pozwala na oglądanie kolejnych (co 1-2 mm) warstw preparatu

13

---