Andrzej Michalski 17.12.2009 r.

Robert Jała

Dominika Machul

SPRAWOZDANIE

Ćwiczenie 8

Wyznaczanie parametrów kinetyki reakcji enzymatycznej

1. Cel ćwiczenia

Celem ćwiczenia jest wyznaczenie stałej K_m, V_max, oraz stworzenie odpowiednich wykresów. W tym celu wykorzystano właściwość zmiany skręcalności roztworu podczas hydrolizy sacharozy do glukozy i fruktozy.

2. Przebieg ćwiczenia

1. Przygotowanie rozcieńczeń

Do kolby na 100 ml wsypano 10g sacharozy, dolano wody destylowanej do kreski i dokładnie rozpuszczono. 50 ml roztworu przelano do osobnej kolby - w ten sposób posiadamy 10% roztwór sacharozy. Do pozostałych 50 ml dolano wody do kreski, wymieszano i odlano kolejne 50 ml - stężenie 5%. Następnie znowu dolano wody do kreski i w ten sposób otrzymano stężenie 2,5%.

2. Pomiar skręcalności

Do 10% roztworu sacharozy dodano 0,1 ml enzymu inwertazy i dobrze wymieszano. Roztwór szybko wlano do rurki polarymetrycznej i rozpoczęto pomiar skręcalności. Pierwszy pomiar przeprowadzono po 30 sekundach po dodaniu inwertazy, a kolejne co 4 minuty od dodania enzymu. Pomiary dokonano dla każdego ze stężeń sacharozy. Wyniki pomiarów notowano i wyliczono dzięki nim odpowiednie wartości.

3. Tabele wyników

Stężenie 10%
Czas	Skręcalność α[◦]	Stężenie substratu Cs [g/100ml]	Stężenie produktu C0-Cs [g/100ml]	Początkowa szybkość reakcji v0 [g/100 ml *min]	1/C0	1/v0
35	11,95	9,23	0,77	1,32	0,10	0,76
240	10,6	8,45	1,55
480	9,55	7,84	2,16
720	8,85	7,43	2,57
960	8,05	6,97	3,03

Stężenie 5%
Czas	Skręcalność α[◦]	Stężenie substratu Cs [g/100ml]	Stężenie produktu C0-Cs [g/100ml]	Początkowa szybkość reakcji v0 [g/100 ml *min]	1/C0	1/v0
30	5,7	4,46	0,54	1,02	0,20	0,98
240	5,1	4,11	0,89
480	4,35	3,67	1,33
720	3,6	3,24	1,76
960	3	2,89	2,11

Stężenie 2.5%
Czas	Skręcalność α[◦]	Stężenie substratu Cs [g/100ml]	Stężenie produktu C0-Cs [g/100ml]	Początkowa szybkość reakcji v0 [g/100 ml *min]	1/C0	1/v0
20	3	2,32	0,19	0,56	0,40	1,80
240	2,35	1,94	0,56
480	1,8	1,62	0,88
720	1,35	1,36	1,14
960	1,1	1,21	1,29

4. Wykresy

5. Obliczanie stałych K_m oraz V_max

Wzór lini trendu dla wykresu Lineweavera - Burka:

Aby obliczyć V_max należy obliczyć f(0), a następnie odwrócić wynik:

Aby obliczyć stałą K_m należy obliczyć f(x)=0, a następnie odwrócić wynik:

6. Wnioski

Wykresy zmian produktów w czasie na początku szybko rosną, natomiast później prędkość spada. Spowodowane jest to ciągłym zmniejszaniem się stężenie sacharozy w roztworze, a co za tym Idze - zmniejszeniem prędkości jej rozkładu.

Wyliczona wartość stałej K_m , (która jest dosyć wysoka i wynosi 10,2), jest to stężenia substratu przy którym prędkość wynosi połowę prędkości maksymalnej V_max. Nasze stężenia (10, 5, 2.5 %) są trochę zbyt niskie. Brakuje nam stężenia powyżej 10%, aby lepiej pokazać wszystkie zależności na wykresie.

Wysoka wartość stałej K_m, (a więc słabe powinowactwo substratu do enzymu) może być spowodowane słabą jakością enzymu - inwertazy.

Prędkości początkowe zostały wyliczone na podstawie początkowych zmian stężeń sacharozy. Dla stężenia 10% pierwszy pomiar odbył się po około 35 sekundach i prędkość została policzona właśnie dla tych pierwszych sekund. Dla kolejnego stężenia pomiar odbył się już szybciej (ze względu na nabieranie wprawy ). Dla ostatniego stężenia pierwszy pomiar zrobiliśmy już po 20 sekundach. Niestety możliwe, że te wartości mogą nie być bardzo dokładne, ponieważ występowały opóźnienia czasowe podczas włączania stopera.

V_max

Km

1/V_max

-1/Km

Wykres Km

V_max/2

---