STRUKTURY BIAŁEK
LINDSROM-LANG: STRUKTURA I, II & II-RZĘDOWA
STRUKTURA I-RZĘDOWA
OKREŚLA SEKWENCJĘ (LICZBA I KOLEJNOŚĆ) POŁĄCZONYCH AMINOKWASÓW
SEKWENCJA AMINOKWASÓW
STRUKTURA II-RZĘDOWA: OPISUJE KONFORMACJĘ ŁAŃCUCHA PEPTYDOWEGO:
STRUKTURA HELIKALNA vs. POFAŁDOWANY ŁAŃCUCH
HELISA	WSTĘGA
STRUKTURA III-RZĘDOWA
OKREŚLA TRÓJWYMIAROWE POFAŁDOWANIE (WSTĘGA VS HELISA) ŁAŃCUCHA PEPTYDOWEGO
STRUKTURA IV-RZĘDOWA [BERNAL; 1958]
DOTYCZY ASOCJATÓW BIAŁKOWYCH W KOMPLEKSY MOLEKULARNE
WZAJEMNE USYTUOWANIE PODJEDNOSTEK
STRUKTURY II^#, III^# & IV^# RZĘDOWE TWORZĄ WSPÓLNIE KONFORMACJĘ BIAŁKA
ANALIZA BIAŁEK/PEPTYDÓW
1. ROZSZCZEPIENIE KOMPLEKSU PEPTYDÓW (BIAŁEK)
2. ROZDZIAŁ SKŁADOWYCH PODJEDNOSTEK PEPTYDOWYCH/ BIAŁKOWYCH
2.1. PRZERWANIE MOSTKÓW DISIARCZKOWYCH
3. SELEKTYWNA DEGRADACJA ŁAŃCUCHA BIAŁKA/PEPTYDU
4. ANALIZA SKŁADU AMINOKWASOWEGO PEPTYDU/BIAŁKA & MASY CZASTECZKOWEJ
5. OZNACZENIE AMINOKWASU N-KOŃCOWEGO & C-KOŃCOWEGO
6. ANALIZA SEKWENCJI PODJEDNOSTKI
Opisano ponad 1000 struktur białek (15000 prac).
7. WERYFIKACJA SEKWENCJI POPRZEZ SYNTEZĘ
1. ROZSZCZEPIENIE KOMPLEKSU PEPTYDÓW/ BIAŁEK
DENATURACJA: DSS, MOCZNIK

3. HYDROLIZA SPECYFICZNA ŁAŃCUCHÓW PEPTYDOWYCH
3.1. HYDROLIZA ENZYMATYCZNA ŁAŃCUCHÓW PEPTYDOWYCH
3.1.1. EGZOPEPTYDAZY
AMINOPEPTYDAZY (AP)		KARBOKSYPEPTYDAZY (CP)
np. Leucyloaminopeptydaza (LAP)		CP-A		CP-B
		odcinają AK^C z wyjątkiem His, Arg, Lys, Pro		odcinają AK^C: Lys, Arg, Orn
3.1.2. ENDOPEPTYDAZY
PROTEAZY: trypsyna, chymotrypsyna, pepsyna, papaina, subtylizyna, elastaza, termolizyna
Trypsyna:	Chymotrypsyna		Subtylizyna	Elastaza
AK: Lys; Arg	AK: Phe, Tyr, Trp		AK: Gly, Ser, Phe, Tyr, Trp	AK: Aminokwasy obojętne

3.2. HYDROLIZA CHEMICZNA ŁAŃCUCHÓW PEPTYD.

3.2.1. DZIAŁANIE BrCN

3.2.2. DZIAŁANIE NBS

ANALIZA SEKWENCYJNA PEPTYDÓW

4. WYZNACZANIE SKŁADU AMINOKWASOWEGO PEPTYDÓW

4.1. Wyczerpująca degradacja hydrolityczna peptydu do aminokwasów. Rozdział i oznaczanie aminokwasów.

5. OZNACZANIE GRUP KOŃCOWYCH PEPTYDU

5.1. Oznaczanie Aminokwasu N-Końcowego

5.1.1. Metoda Sangera

5.1.2. Metoda Dansylowa

5.1.3. Inne Metody

5.2. OZNACZANIE AMINOKWASU C-KOŃCOWEGO

5.2.1. METODY ENZYMATYCZNE

Egzopeptydazy: Karboksypeptydaza A i B

5.2.2. METODY CHEMICZNE

5.2.2.1. Metoda Akabori'ego

5.2.2.2. Metoda Fromageot'a

6. ANALIZA SEKWENCJI PODJEDNOSTKI

6.1. STOPNIOWA DEGRADACJA ŁAŃCUCHA PEPTYDOWEGO

6.1.2. METODY CHEMICZNE

6.1.2.1. METODA EDMANA

6.1.2.2. Degradacja EDMANA Peptydu Zawieszonego na Nośniku Stałym

1. Zawieszenie peptydu na nośniku

2. N-Deprotekcja peptydu zawieszonego na fazie stałej

3. Reakcja peptydu zawieszonego na fazie stałej z izotiocyjanianem fenylu (PhNCS) (konwersja peptydu do PTC-peptydu)

4. Odszczepienie aminokwasu N-końcowego w postaci PTH-AK

5. Powtórzenie cyklu.

6.1.2.3. METODA SANGERA SEKWENCJONOWANIA BIAŁEK

1. INSULINA A PODDAWANY JEST CZĘŚCIOWEJ HYDROLIZIE

2. FRAGMENT C-T-S-I-C-S-L-Y IZOLOWANY JEST Z MIESZANINY HYDROLITYCZNEJ I PODDAWANY REAKCJI Z ODCZYNNIKIEM SANGERA (DNP-F)

3. ZMODYFIKOWANY DNP-PEPTYD PODDAWANY JEST ŁAGODNEJ (CZĘŚCIOWEJ) HYDROLIZIE

A. ODDZIELA SIE FRAKCJE DNP-(AK)n OD (AK)n.

B. MIESZANINA DNP-(AK)n PODDAWANA JEST FRAKCJONOWANIU

C. FRAKCJE PODDAWANE SĄ WYCZERPUJĄCEJ HYDROLIZIE

4. NA PODSTAWIE ANALIZY HYDROLIZATÓW FRAKCJI DOKONYWANE JEST “SKŁADANIE” SEKWENCJI PEPTYDU:

DNP-C → DNP-C-T → DNP-C-T-S → DNP-C-T-S-I → DNP-C-T-S-I-C → DNP-C-T-S-I-C-S → DNP-C-T-S-I-C-S-L → DNP-C-T-S-I-C-S-L-Y

ANALIZATOR AMINOKWASÓW Z DERYWATYZACJĄ POST-KOLUMNOWĄ MOORE'A I STEINA

REAKCJA DETEKCYJNA

λmax = 540 nm, 1 µg (10 nmoli)

REAKCJA DETEKCYJNA AK Z FLUORESCAMINĄ

λmax = 336 nm, 10 pmoli

ANALIZATOR AMINOKWASÓW Z DERYWATYZACJĄ PRE-KOLUMNOWĄ

REAKCJA DERYWATYZACYJNA: AK → PTC-AK

λmax = 270 nm, (1 nmol)

IZOLACJA TRF Z MATERIAŁU BIOLOGICZNEGO
TYREOLIBERYNA (TRF) - HORMON UWALNIAJĄCY TYREOTROPINĘ (STYMULACJA TARCZYCY)
USTALENIE SEKWENCJI TRF
IZOLACJA TRF Z PODWZGÓRZA OWCY
ETAPY IZOLACJI	MASA	U/mg
MATERIAŁ WYJŚCIOWY: 300 000 podwzgórzy owiec	25 000 g
1. EKSTRAKCJA CHCl3/EtOH	294 g	1
2. ULTRAFILTRACJA	71 g	3
3. SEPHADEX-G-25	16 g	16
4. HPLC (×2)	246 mg	800
5. HPLC (×4)	2 mg	58500

NIEJEDNOZNACZNE WYNIKI SEKWENCJONOWANIA -

KONIECZNA SYNTEZA TOTALNA PEPTYDU [1969]

Od 1969 r. - ponad 100 publikacji nt. korelacji SAR-TRF

17

---