1

ANALIZA INSTRUMENTALNA TLC i HPLC - ćwiczenia

dr int Kinga Drzewiecka

Zasady zaliczenia:

Warunkiem zaliczenia jest obecność na ćwiczeniach, zaliczenie kolokwium na ocenę przynajmniej dostateczną oraz opracowanie indywidualnego raportu z ćwiczeń zgodnego z wymaganiami prowadzącego.

I. Chromatografia cienkowarstwowa aminokwasów (TLC)

Celem ćwiczenia jest identyfikacja oraz analiza jakościowa aminokwasów w roztworze wodnym metodą chromatografii cienkowarstwowej.

Zróżnicowana budowa aminokwasów pozwala na ich rozdział metodami chromatograficznymi (hydrofobowość, pKa, dodatkowe grupy funkcyjne), w tym również stosunkowo prostą metodą chromatografii cienkowarstwowej przeprowadzonej na płytce z warstwą żelu krzemionkowego stanowiącego fazę stacjonarną. Do wykrywania i identyfikacji aminokwasów rozdzielonych wyżej wskazaną metodą służy wiele reakcji barwnych, w tym reakcja ninhydrynowa, pozwalająca na wykrycie do 10'⁹ mola aminokwasu, dająca barwny produkt na powierzchni płytki chromatograficznej (od różowego do fioletowego z wyjątkiem proliny i hydroksyproliny, które dają zabarwienie żółte). Zabarwienie przedstawionych powyżej aminokwasów z ninhydryną pojawia się po ogrzaniu do 80-100 °C.

Materiały i sprzęt:

(1) płytka do chromatografii TLC (płytka aluminiowa pokryta żelem krzemionkowym)

(2) linijka i ołówek

(3) wzorce aminokwasów (0,5 %) i kapilarki (1 pil)

(4) komora chromatograficzna

(5) eluent (1-butanol-kwas octowy-woda, v/v = 4:1:1)

(6) wywoływacz (0,3 % rozwór ninhydryny w acetonie)

Wykonanie:

1. Przygotowanie płytki

Na płytce do chromatografii cienkowarstwowej należy zaznaczyć delikatnie ołówkiem linię startu (ok. 10 mm od dolnej krawędzi płytki), starając się nie uszkodzić powirzchni żelu. Na linii startu zaznacza się punkty nanoszenia roztworów pojedynczych wzorców aminokwasów (7 aminokwasów, w objętości 1 ul) w odstępie ok. 10 mm. Pozostawić 15 mm przerwy i następnie nałożyć na płytkę taką samą objętość analizowanego roztworu zawierającego 1 lub 2 aminokwasy, które należy zidentyfikować. Na przygotowaną płytkę nanosi się kapilarkami roztwory w taki sposób, aby powstały plamki o średnicy nie większej niż 3 mm.