20110331212

2. Przeprowadzani* ISSR-PCR Odczynniki I sprzęt

•    ds DNA (matryca)

•    starter DNA oznaczony jako ISSR4 (lOyM)

•    dNTP Mix (2.5 mM)

•    bufor reakcyjny 10x

•    poRmeraza 7*7(20/mu

•    woda dejonizowana

•    termocykler

•sterylne probówbkl Eppendorfa

Postępowanie (wszystkie etapy należy wykonywać w rękawiczkach)

1. W probówce Eppendorf (1.5 mL) przygotować premiks PCR (50 pL) na lodzie reem|yry poniżej wymienione składniki oprócz matrycy:

Skład mieszaniny i stężenia początkowe poszczeqólnvch składników		Stężenia końcowe poszczególnych składników
HjO dejonizowana		Uzupełnić do 50 ul
Bufor reakcyjny	10x	1 X
dNTP Mix	2.5 mM	0.2 mM
Starter ISSR4	10 UM	2 uM
1 Polimeraza Tao	_	3U

2.    Całość mieszaniny delikatnie wymieszać I żwirować w mikrokapsule

3.    Rozporcjować po 20 pL premlksu do dwóch probówek PCR (0.2 mL)

4.    Do jednej probówki z prem iksem (20 pL) dodać 100 ng matrycy DNA (1-2 pL), a do drugiej probówki z premtksem (20 pL) dodać 1000 ng matrycy DNA (1-2 gl). Całość żwirować i przeprowadzić reakcję amplifikacjl w termocyklerze przy wykorzystaniu programu Issr4 (patrz postępowanie z termocyklerem): denaturacja wstępna w temp. 94°C przez 5 minut, 40 cykli PCR (warunki termiczne dla każdego cyklu są następujące: 94°C przez 30s; 60°C przez 1 min; 72*C przez 30s) I 72°C przez 5 minut.

Postępowanie z termocyklerem

1. Włączyć urządzenie

2.    Wstawić próbki do termocyklera I zakręcić pokrywę

3.    Wybrać za pomocą strzałek katalog o nazwie Studenta

4.    Nacisnąć Login (panel dolny)

5.    Nacisnąć Program (panel górny)

6.    Nacisnąć Enter

6.    Wybrać odpowiedni program (Issr4)

7.    Nacisnąć Start

8.    Po zakończeniu programu, nacisnąć Stop I potwierdzić po sygnale dźwiękowym

9.    Odkręcić pokrywę I wyjąć próbki