3

Zdecydowanie lepszym, z uwagi na równe rozłożenie punktów opisujących prostą, sposobem graficznego wyznaczania wartości V_max i K_M jest metoda Eadie-Hofstee zwana również metodą Woolf-Augustinsson-Hofstee (Rys. 2b). Opisuje ją następujące przekształcenie równania Michaelisa-Menten:

V_max ^— v (Km/[S] + [S]/[S])

V_max = vK_M/[S]+V

V = - V Km /[S] + V_max

Wartość V_max odczytujemy bezpośrednio z wykresu w miejscu przecięcia się prostej z osią y, natomiast wartość Km obliczamy z nachylenia prostej Km = tga = y/x.

Zasada oznaczania aktywności kwaśnej fosfatazy

Kwaśna fosfataza (EC 3.1.3.2) należy do klasy hydrolaz i katalizuje reakcję odszczepienia reszty fosforanowej od cukrowców, białek, tłuszczowców, nukleotydów i innych naturalnych estrów fosforanowych. Enzym ten hydrolizuje również estry fosforanowe fenoli, np. p-nitrofenylofosforan. Fosfataza hydrolizując ten związek uwalnia p-nitrofenol, który w środowisku alkalicznym ma barwę żółtą. Natężenie barwy mierzone przy długości fali X = 405 nm jest proporcjonalne do ilości zhydrolizowanego substratu.

O

O! ^    • M/ataza    /    \

-O —P- OH + H,0-* Q;N~\ /-QH + H₃P0₄

OH

p-nitrofen ylo fosforan    o-nitrofenol

Fosfataza kwaśna jest enzymem lizosomalnym, glikoproteiną zawierającą około 13% węglowodanów. W organizmie człowieka występuje wiele izoform fosfatazy kwaśnej. Wzrost aktywności izoformy sterczowej (PAP) w surowicy ludzkiej wskazuje na zmiany nowotworowe w prostacie. Inna izoforma kwaśnej fosfatazy jest markerem resorpcji (destrukcji) kości.

3