Agrobiotechnologia 2

■;f -

Ćwiczenie 1

Izolacja DNA z materiału roślinnego

-    zamrożony lub świeży materiał roślinny rozetrzeć na proszek w moździerzu przy użyciu ciekłego azotu (rozbicie struktur komórkowych, uwolnienie DNA);

-    do wychłodzonej probówki typu Eppendorf o pojemności 1,5 ml przenieść ok 100 mg roztartą tkanki;

-    dodać natychmiast 700 pl bufoni ekstrakcyjnego D (denaturacja białek tworzących kompleksy z DNA);

-    zawartość probówki bardzo dokładnie wymieszać (vortex);

-    dodać 600 ul mieszaniny chloroform:alkohol izoamylowy (24:1) (oddzielenie DNA od innych struktur komórkowych i chlorofili);

-    zawartość probówki bardzo dokładnie wymieszać ok 5 min

-    otrzymaną emulsję wirować 10 min 14 000 rpm;

-    odebrać górną wodną fazę (ok 500 pl) do nowych probówek;

-    dodać 500 ul schłodzonego (-20stC) izopropanolu (wytrącenie DNA);

-    całość delikatnie wymieszać aż do pojawienia się strątu;

-    wirować 10 min. 14 OOOrpm;

-    po wirowaniu nadsącz usunąć;

-    dodać 800 ul 80% etanolu, opłukać probówki wewnątrz obracając je w palcach;

-    wirować 5 min. 14 000 rpm;

-    nadsącz (alkohol) usunąć;

-    otrzymany osad wysuszyć w próżni;

-    rozpuścić w 100 pl jałowej wody MiHiQ.

-    zmierzyć stężenie preparatu.

Przygotowanie elektroforezy dla wyizolowanych preparatów DNA Przygotować mieszaninę (w najmniejszej probówce o objętości 200 pl):

-8plH₂0

-    2 pl izolat DNA

-    1 pl barwnik ładujący

11 ul (vortex, wirowanie), nakładać na żel

Elektroforezę prowadzić na 1 % żelu agarozowym przy natężeniu ok. 5 V/cm przez 1 h.