image0 (4)

42

Izolowanie i oczyszczanie wirusów z materiału roślinnego

43

Rozdział 10

Izolowanie i oczyszczanie wirusów

z materiału roślinnego

10.1. Założenia ogólne

To, co nazywamy sokiem, a co uzyskujemy przez roztarcie materiału roślinnego w moździerzu, jest w rzeczywistości zawiesiną fragmentów rośliny (różnej wielkości kawałków tkanki roślinnej, pojedynczych komórek, uwolnionych z komórek organelli lub ich fragmentów) w roztworze rozpuszczalnych składników komórek roślin. Cząstki wirusa występują w soku w stanie wolnym, ale znaczna ich część jest związana z różnymi składnikami tej zawiesiny.

Sokiem możemy posługiwać się w różnych eksperymentach wymagających zakażania roślin wirusem, ale nie możemy określić ani składu wirusa (zawartość białka i kwasu nukleinowego oraz innych składników cząstek wirusa), ani tym bardziej dalszych szczegółów jego budowy (rodzaj i struktura kwasu nukleinowego, architektura cząstek) i funkcji (funkcja i lokalizacja genów albo otwartych ramek odczytu, struktura i funkcja poszczególnych białek strukturalnych i niestrukturalnych). Nie możemy też wyprodukować^ surowicy, ani prowadzić szczegółowych badań serologicznych. Badania takie możemy prowadzić dopiero po wyizolowaniu (wyosobnieniu, ekstrakcji) wirusa z materiału roślinnego oraz oczyszczeniu go, to znaczy oddzieleniu od innych składników tej zawiesiny i roztworu i uzyskaniu w stanie możliwie czystym. Przy okazji dążymy również do zagęszczenia (wzbogacenia) zawiesiny cząstek wirusa, ponieważ wirusy występują w roślinacM z reguły w niskiej koncentracji. Metody oczyszczania wirusa powinny być tak dobrane, by nie zmieniały właściwości wirusa (przede wszystkim infekcyjności, struktury powierzchni kapsydu, a zatem cech immunogenicznych oraz wielkości i kształtu wirionów) i by obserwowane przez nas w czystym preparacie wirusa jego cechy były rzeczywiście jego cechami, a nie artefaktami zastosowanych metod oczyszczania.

Przystępując do oczyszczania wirusa można zaplanować procedurę opierającą ste na jednej z dwóch możliwych zasad:

. albo próbujemy usunąć z zawiesiny wszystkie jej składniki niebędące cząstkami wirusa oraz wszystkie związki rozpuszczalne w taki sposób, by w zawiesinie pozostały wyłącznie cząstki wirusa w wodzie lub w roztworze o znanym składzie i właściwościach;

. albo wytrącamy z zawiesiny cząstki wirusa i sporządzamy z nich czystą zawiesinę w środowisku o znanym składzie i właściwościach.

W praktyce, w procedurach oczyszczania wirusów stosujemy na różnych jej etapach, na przemian obie te zasady.

Praktycznie nie jest możliwe uzyskanie idealnie czystego preparatu wirusa. Za oczyszczony uznaje się taki preparat, który nie zmienia już swego składu ani właściwości mimo kontynuowania procedury oczyszczania. Pożądany stopień czystości preparatu zależy od tego, do czego zamierzamy użyć uzyskany preparat, to znaczy od celu oczyszczania.

•    Największy stopień czystości wymagany jest dla preparatów przeznaczonych do badań chemicznych, biochemicznych, fizykochemicznych i molekularnych.

•    Preparat, który ma być użyty do produkcj i surowicy nie musi być już tak czysty i wystarczy, że jest wolny od fragmentów tkanki, komórek roślinnych lub ich fragmentów oraz makromolekuł, a zwłaszcza białka niebędącego białkiem wirusowym.

•    Najmniejsze wymagania stawiamy preparatom przeznaczonym do oglądania w mikroskopie elektronowym.

Oczywiście, w każdym przypadku należy dążyć do uzyskania jak najczystszego preparatu wirusa, jednak na każdym etapie oczyszczania następują zawsze straty pewnej ilości wirusa. Wydłużanie procedury oczyszczania pochłania też czas i pieniądze. Każda procedura oczyszczania jest więc rozsądnym kompromisem pomiędzy dążeniem do uzyskania preparatu o najwyższym stopniu czystości a ograniczaniem strat wirusa i kosztów prowadzenia procedury.

W fachowej literaturze można znaleźć opisy procedur oczyszczania bardzo wielu różnych wirusów i, przystępując do oczyszczania konkretnego wirusa, możemy zawsze wybrać opisaną już procedurę oczyszczania tego właśnie albo pokrewnego mu, a więc Podobnego wirusa. Niestety, nie zawsze jest to gwarancją sukcesu, nawet jeśli źródłem wirusa jest ten sam gatunek rośliny. Nie zawsze wszystkie detale procedury są dostatecznie szczegółowo opisane i nie zawsze udaje się je dokładnie odtworzyć. W różnych Moratoriach posługujemy się też różną aparaturą i różnymi odczynnikami. W każdym Więc przypadku, zanim w naszych rękach określona procedura stanie się rutyną, trzeba raktować ją tak, jakby była to procedura opracowywana na nowo, to znaczy na każdym J^eJ etapie sprawdzać, czy nie nastąpiły nadmierne straty wirusa, formowanie się dużych ^a§regatów cząstek, co może prowadzić do strat, utrata infekcyjności, zmiana struktury P°wierzchni kapsydu lub inne, niepożądane zmiany. Krótko mówiąc, po każdym etapie Procedury oczyszczania konieczne jest sprawdzanie czystości preparatu oraz ewentual-ⁿyoh strat i zmian wirusa.