image1 (9)

46 Izolowanie i oczyszczanie wirusów z materiału roślinnego

10.4. Sposoby oczyszczania wirusów

Oczyszczaniem wirusa nazywamy postępowanie zmierzające do uzyskania go w stanie możliwie czystym, a więc uwolnienie cząstek wirusa od wszelkich możliwych zanieczyszczeń - komórek roślinnych, organelli komórkowych, fragmentów struktur komórkowych, wielkocząsteczkowych związków organicznych i drobniejszych od cząstek wirusa molekuł, w tym również organicznych i nieorganicznych związków rozpuszczalnych w wodzie.

Wstępne oczyszczanie chemiczne. Do tych wstępnych etapów należy opisane już klarowanie soku. Kolejnym etapem jest, z reguły, wytrącanie wirusa ze sklarowanego soku, czyli precypitacja wirusa.

Wirus można wytrącić z zawiesiny wodnej przez wysalanie (np. dodanie siarczanu amonowego w stężeniu, które doprowadzi do precypitacji nukleoproteiny wirusa) albo przez doprowadzenie, np. przez zakwaszanie kwasem octowym, do punktu izoelektrycznego, to znaczy do takiej wartości pH, w której białka wirusa utracą ładunki, przestaną się odpychać i strącą się tworząc duże agregaty. Do precypitacji wirusa można użyć także odczynników organicznych - etanolu, acetonu lub glikolu polietylenowego (PEG). Precypitat wirusa strąca się na dno probówki przez niskoobrotowe (do 10 000 g) wirowanie.

Tak uzyskany precypitat wirusa można rozpuścić w odpowiednim środowisku i z kolei postarać się wyeliminować drobnocząsteczkowe rozpuszczalne zanieczyszczenia przez dializę przez odpowiednią błonę wobec wody destylowanej.

Oczyszczanie wirusów przez wirowanie. Wirowanie wykorzystuje się do rozdzielania frakcji cząstek o różnej gęstości, masie i wielkości, a także o różnym kształcie. Jest to więc bardzo dobra metoda oddzielania cząstek wirusów od różnych zanieczyszczeń znajdujących się razem z cząstkami wirusa w wyciśniętym z rośliny soku. Wirowanie może być także użyte do osadzenia (sedymentacji) cząstek wirusa z zawiesiny w soku, co pozwala uzyskać preparaty wirusa zawierające dużą liczbę zagęszczonych cząstek. Szybkość wirowania określa się w obrotach na minutę (obr./min = rpm; ang. Solutions per minutę). Ponieważ jednak wielkość siły odśrodkowej zależna jest również od promienia rotoru wirówki, lepiej jest podawać nie liczbę obrotów, lecz wielkość przyspieszenia, jakiemu poddawane są wirowane cząstki. Wielkość tę podaje się w jednostkach g (1 g to przyspieszenie równe przyspieszeniu ziemskiemu, czyli 9,81 m/s²). Wielkość ta charakteryzuje proces wirowania lepiej niż liczba obrotów rotoru w jednostce czasu.

Szybkość sedymentacji cząstek w czasie wirowania rośnie w miarę:

•    zwiększania liczby obrotów rotoru wirówki w jednostce czasu,

•    zwiększania promienia rotoru wirówki,

•    zwiększania gęstości, masy i wielkości cząstek; dla cząstek kulistych szybkość sedymentacji rośnie proporcjonalnie do kwadratu ich średnicy, a dla cząstek

wydłużonych proporcjonalnie do iloczynu: (średnica cząstki)² x (długość cząstki)²⁷³,

•    wzrostu temperatury wirowanej zawiesiny.

Szybkość sedymentacji cząstek w czasie wirowania maleje w miarę:

•    wzrostu lepkości zawiesiny,

•    wzrostu gęstości rozpuszczalnika.

Wielkością dobrze charakteryzującą zachowanie cząstek, a więc i cząstek wirusa, w czasie wirowania jest stała sedymentacji, czyli tzw. liczba Svedberga. Ponieważ byłaby ona różna dla różnych rozpuszczalników i dla wirowania w różnych warunkach temperatury, zazwyczaj podaje się ją dla wirowania w środowisku wody i w temperaturze pokojowej, to znaczy 20°C (S_20W). Wielkość ta, zwana inaczej współczynnikiem sedymentacji, charakteryzuje całościowo zachowanie cząstek w czasie wirowania. Stałą sedymentacji wyraża się w jednostkach Svedberga (S) i jest to szybkość sedymentacji cząstki w przeliczeniu na jednostkę pola siły odśrodkowej, czyli przyrost prędkości przesuwania się cząstki (dr/dt) w miarę wzrostu promienia i liczby obrotów (rco²):

dr/dt

S =-

rco²

Zwykłe wirówki pozwalają na osiągnięcie przyspieszenia w granicach 10-12 tysięcy g. Dobra wirówka powinna być wyposażona w urządzenie do chłodzenia komory wirowania. Pozwala to na wirowanie w niskiej temperaturze, co bywa konieczne i nie pozwala na wzrost temperatury rotorą na skutek znacznego już, przy osiąganych prędkościach, tarcia. Ultrawirówki są to takie wirówki, które pozwalają osiągnąć przyspieszenie o wielkości zaczynającej się od 30 tysięcy g i sięgające znacznie większych liczb (np. 100 tysięcy g). W tym przypadku chłodzenie jest już konieczne. Ultrawirówka musi też być wyposażona w pompę próżniową. Wirowanie odbywa się w stanie zbliżonym do próżni w celu zminimalizowania oporów tarcia. Wirówki analityczne wyposażone są w dodatkowe urządzenia pozwalające na śledzenie procesu wirowania i analizę optyczną frakcji uzyskanych po wirowaniu.

Rotory kątowe to lite rotory metalowe, w których nawiercone są pod określonym kątem, równo rozmieszczone na obwodzie rotoru studzienki, w które wkłada się probówki zawierające wirowane próbki. Dzięki temu probówki nie zmieniają swojego położenia w czasie wirowania. Pozwala to na skrócenie czasu wirowania. Siła odśrodkowa nie działa tu prostopadle do dna probówki, lecz prostopadle do określonego miejsca na jej zewnętrznej (w stosunku do osi obrotu) ściance. Rotory kątowe nadają się przede wszystkim do wirowania, którego celem jest osadzenie osadu (pellet, strąt) na ściance probówki. Mniej nadają się do rozdzielania frakcji ciekłych, bo stosunkowo duże jest ryzyko wymieszania, choćby częściowego, rozdzielonych frakcji w czasie wyjmowania probówki ze studzienki po zakończeniu wirowania.