image0 1

44 Izolowanie i oczyszczanie wirusów z materiału roślinnego

10.2. Ocena czystości preparatu i strat wirusa

na poszczególnych etapach procedury oczyszczania

Test biologiczny. Straty wirusa można oceniać mierząc względną koncentrację wirusa liczbą plamek lokalnych uzyskanych na odpowiednio dobranej roślinie wskaźnikowej (zob. rozdział 7). Można w ten sposób dość dokładnie ocenić spadek (ubytek) infekcyjności preparatu po każdym etapie procedury oczyszczania. Spadek infekcyjności nie zawsze jednak jest wynikiem rzeczywistych strat wirusa. Czasem bywa efektem tworzenia agregatów cząstek. Metoda ta nie nadaje się do oceny poziomu zanieczyszczeń. Trzeba też pamiętać, że przed inokulacją należy usunąć z preparatu wszelkie substancje, które albo mogłyby być inhibitorami infekcji, albo mogłyby uszkadzać liście inokulowa-nych roślin, a w toku oczyszczania używa się wielu takich substancji i pozbycie się ich nie zawsze jest proste.

Test serologiczny (zob. rozdział 11.2.). Jest to bardzo szybka i stosunkowo prosta, ale mało dokładna metoda oceny aktualnej ilości wirusa w preparacie, a więc i strat w toku procedury oczyszczania. Trzeba po prostu oznaczyć miano wirusa wobec standardowego stężenia przeciwciał. Jeśli dysponujemy surowicą uczuloną na białko rośliny stanowiącej źródło wirusa, możemy również ocenić poziom zanieczyszczenia preparatu wirusa tym białkiem. Wynik będzie jednak jeszcze mniej dokładny.

Pomiar spektrofotometryczny. Jest to również bardzo szybka i bardzo prosta metoda polegająca na mierzeniu pochłanialności (absorbancji) fal UV o długości charakterystycznej dla białka (260 nm) i kwasów nukleinowych (280 nm). Aby mieć pewność, że mierzymy zawartość nukleoproteiny wirusa trzeba wyliczyć stosunek A₂₆₀ do A_2S0 (A₂₆o/28o) i P^orównać go z charakterystyczną dla wirusa wartością A,_60/2g0 wynikającą z proporcji między ilościąbiałka i ilościąkwasu nukleinowego w wirionach. Jest to jedenz najczęściej stosowanych sposobów oceny strat i stopnia czystości preparatu.

Ocena przy użyciu mikroskopu elektronowego (zob. rozdział 12.). W mikroskopie elektronowym można zobaczyć zarówno cząstki wirusa, jak i cząstki niektórych przynajmniej zanieczyszczeń, co pozwala dobrze ocenić zarówno straty wirusa, jak i rodzaj i ilość zanieczyszczeń w preparacie. Jest to bardzo przydatna metoda pod dwoma warunkami: po pierwsze, łatwy dostęp do mikroskopu elektronowego, po drugie, możliwość użycia szybkiej i prostej techniki przygotowania preparatu do oglądania (np. barwienie negatywowe).

Ocena wizualna. Wizualnie możemy wyłącznie wstępnie ocenić czystość preparatu. Obecność cząstek wirusów w zawiesinie nie powoduje żadnego jej wybarwienia, a więc dopóki preparat ma jakąkolwiek barwę, nie jest czysty. Z drugiej strony całkowicie bezbarwny preparat też może nie być czysty. Jeśli oglądana zawiesina jest trochę choćby zmętniała, to znaczy, że zawiera ona cząstki większe od wirusów, a więc zanieczyszczenia. Obecność w zawiesinie cząstek o wymiarach zbliżonych do wymiarów wirusów

wywołuje lekką opalizację zawiesiny oglądanej w świetle przechodzącym. Nasilenie opa-lizacji jest tym większe, im większe cząstki znajdują się w zawiesinie, a więc zbyt silni opalizacja jest już świadectwem zanieczyszczenia preparatu.

10.3. Izolowanie (ekstrakcja) wirusów z materiału

roślinnego

Wybór szczepu wirusa i rośliny źródłowej. Staramy się wybrać do oczyszczania szczep wirusa dobrze się namnażający, a więc uzyskujący wysoką koncentrację w roślinie. Dobrze jest, jeśli szczep ten wywołuje wyraźne objawy na dobrej roślinie wskaźnikowej. Bezwzględnie powinien to być szczep stabilny w soku, a poza tym stabilny genetycznie, to znaczy nieulegający zbyt często mutacjom.

Jako roślinę stanowiącą źródło wirusa do oczyszczania, czyli roślinę do namnaża-nia wirusa wybieramy roślinę łatwą w uprawie, łatwą do inokulacji, niezawierającą inhibitorów wirusa ani żadnych ciemnych barwników. Dobrze jest, jeśli materiał uzyskany z tej rośliny (najczęściej liście) nie zawiera zbyt dużo tkanki mechanicznej. Roślina taka powinna zapewniać dobre namnażanie wirusa, a więc jego wysoki „plon” po oczyszczeniu. Oczywiście, roślina ta musi być wolna od innych wirusów. Najczęściej nie jest to wcale roślina będąca naturalnym gospodarzem wirusa.

Warunki ekstrakcji wirusa z rośliny i wstępne klarowanie soku. Proce-

-w

durę rozpoczynamy od dużej ilości materiału roślinnego, nawet rzędu 500-1000 g, a więc do rozdrabniania powinniśmy użyć homogenizatora, najlepiej z chłodzeniem. Ekstrakcję wirusa przeprowadza się na ogół w środowisku zbuforowanym (0,01— 0,06 M bufor fosforanowy pH = 7,0-7,5). Często dodaje się środka redukującego, czyli tzw. antyutleniacza (zob. rozdział 5.1.) i substancji wiążącej jony metali, np. soli sodowej kwasu wersenowego (sól sodowa kwasu etylenodwuaminoczterooctowe-go, Na,EDTA). Wszystko to tworzy, po roztarciu i homogenizacji tkanki roślinnej, wodną zawiesinę. Jeśli wymiesza się ją z rozpuszczalnikiem organicznym (butanol, pentanol, oktanol, chloroform), powstanie nietrwała emulsja, która łatwo rozdziela się na fazę wodną i fazę organiczną. W fazie organicznej znajdą się wszystkie większe fragmenty tkanki roślinnej i organelle komórkowe, podczas gdy wyekstrahowany wirus znajdzie się w fazie wodnej. Wystarczy więc fazy rozdzielić (proces ten z reguły przyspiesza się poddając uzyskaną emulsję niskoobrotowemu wirowaniu (do 10 000 g). Otrzymujemy w ten sposób tzw. sklarowany sok. Dalszym etapem może być oczyszczanie wirusa, to znaczy uzyskanie go w stanie czystym, wolnym od wszelkich innych substancji.