Cw 3 (5) instrukcja

Nadcksprcsja białek w E. coli BL21(DE3) Ćwiczenia 3

1. Przygotowanie lizatów E. coli BL21(DE3):

-    Próby uzyskane na poprzednich ćwiczeniach:

a)    BL21(DE3) - „0” (przed indukcją) i „1”, „2”, „3" (po indukcji 1PTG)

b)    BL21(DE3)/pET28a-białko - „0” (przed indukcją) i „1”, „2”, „3" (po indukcji 1PTG)

-    Osady bakteryjne rozmrozić na lodzie i zawiesić w 200 |Jl DBL. Mieszać delikatnie przez 50 min w temperaturze pokojowej.

-    Odwirować (15 000 x g, 10 min, RT), ostrożnie zebrać supematant (lizat). Lizat z próby „3” BL21(DE3)/pET28a-bialko wykorzystać do oczyszczania białka, a pozostałe lizaty zachować do elektroforezy.

2. Oczyszczanie białek nadeksprymowanych w E. coli BL21(DE3):

-    Do lizatu „3’' BL21(DE3)/pET28a-białko dodać 50 pj 1 złoża Ni-NTA i mieszać delikatnie przez 50 min.

-    Mieszaninę złoża z lizatem przenieść do kolumny, krótko żwirować, a płyn który przepłynął (FT-flow through) zachować do elektroforezy.

-    Złoże przepłukać 200 [Jl DWB, żwirować i zachować frakcję W do elektroforezy.

-    Białko związane specyficznie na złożu wypłukać dwoma 50 |Jl porcjami DĘBI, a następnie DEB2 i zebrać oddzielne freakcje (eluaty) - Ei 1, E_t2, E₂1, E₂2.

-    Wszystkie lizaty i frakcje FT, W oraz Eil, Ei2, E₂1, E₂2 zamrozić i przechować w temp. -20°C do następnych ćwiczeń.

Bufory:

-    DLB (denaturing lysis buffer - bufor do lizy i wiązania) - 100 mM NaFfPCE, 10 mM Tris-Cl,

8 M mocznik, pH 8,0.

-    DWB (denaturing wash buffer - bufor płuczący) - skład jw., pH 6,3.

-    DĘBI (denaturing elution buffer - bufor do elucji 1) - skład jw., pł 1 5,0.

-    DEB2 (denaturing elution buffer - bufor do elucji 2) - skład jw., pH 4,5.

3. Trawienie restrykcyjne plazmidu pET28a-białko:

-    Przygotowanie mieszaniny reakcyjnej, z wykorzystaniem enzymów Bgl II lub EcoR I.

-    Inkubacja - lh, w temp. zależnej od użytego enzymu restrykcyjnego.