instrukcja ćw 1

Nadckspresja białek w E. coli BL21(DE3)

Ćwiczenia 2

1. Przygotowanie hodowli płynnych E. coli BL21(DE3):

_ Z permanentów E. coli - BL21(DE3) i BL21(DE3) staransformowanych plazmidem pET28a-białko wykonano posiewy redukcyjne na płytkach (odpowiednio) LB i LB_ka„. Bakterie hodowano przez noc w temp. 30°C.

-    Zaszczepiono 3 ml pożywek płynnych pojedynczymi koloniami bakteryjnymi i hodowano przez noc (ok. 16 h) w temp. 30°C z wytrząsaniem -250 rpm.

-    Zaszczepiono 20 ml pożywek płynnych 1/100 objętości całonocnych hodowli bakteryjnych i hodowano dalej w tych samych warunkach do osiągnięcia OD₆oo=0,8.

a)    20 ml LB + 0,2 ml hodowli BL 21(DE3)

b)    20 ml LBkan + 0,2 ml hodowli BL21(DE3) stransformowanej pET28a-białko

-    Po osiągnięciu odpowiedniego OD^o pobrano próbę „0” - 1 ml hodowli, następnie krótko żwirowano a osad zamrożono w ciekłym azocie.

2. Indukcja nadekspresji obcego białka z plazmidu pET28a:

-    Do pozostałej objętości pożywek dodano 0,5 M IPTG, tak, aby jego końcowe stężenie w pożywkach wynosiło 1 mM.

-    Hodowle inkubowano dalej, a próby (1 ml) pobierano kolejno po - 0,5h; lh i l,5h - od momentu indukcji. Z próbami postępowano jak wyżej.

0 0 0 0

3. Izolacjji plazmidu pE I 28a-bialko metod:) lizy alkalicznej:

z całonocnej hodowli E. coli BL21(DE3) + pET28a-białko pobrać do eppendorfa 2 ml

Komórki żwirować (10 000 x g, 3 min, RT), supcrnatant /lać.

Osad bakterii zawiesić w 250 Mł buforu I (BI). Dodać 250 pjI buforu 2 (B2), natychmiast zamieszać (delikatnie) i inkubować w temp. pokojowej nie dłużej niż 5 min. Dodać 350 |j| lodowato zimnego buforu 3 (B3) i szybko ale delikatnie wymieszać.

-    Osad żwirować (12 000 x g, 10 min, 4”C).

Supematant przenieść do czystej probówki i dodać 0,9 objętości izopropanolu. Chwilę inkubować w temp. pokojowej, a następnie żwirować (15 000 x g, 15 min, 4"C)

-    Izopropanol zlać, a osad przemyć 200 pl 70% EtOH. Żwirować (15 000 x g, 5 mm, 4T)

-    Etanol zlać, a osad wysuszyć i zawiesić w 30 pi Tris-Cl o pl I 8,0.