Enzymy restrykcyjne (1)

Klasa III

aktywność in vitro zależy od ATP, Mg ²⁺ i S-adenozylometioniny (nie jest konieczna, ale wzmacnia aktywność)

substratem jest dwuniciowy DNA

-    cięcie bardziej precyzyjne niż w klasie I, w pewnej odległości (średnio 25 nukleotydów) od rozpoznawanej nie zmetylowanej sekwencji

-    rozpoznawana sekwencja nie jest palindromowa

-    zawierają dwa typy podjednostek

Enzymy klasy II znalazły największe zastosowanie w biologii molekularnej, m.in. w konstrukcji map restrykcyjnych, klonowaniu i obróbce DNA,

Sekwencje palindromowe - posiadają oś symetrii

Nacięcia w obu niciach mogą leżeć naprzeciw siebie - powstają fragmenty dające tępe końce (HaeIII) lub w pozycjach nie leżących naprzeciwko - lepkie końce (kohezyjne), w postaci jednoniciowych, kilkunukleotydowych końców 5’ (£«>RI), ułatwiające łączenie fragmentów DNA ze sobą; niektóre enzymy wytwarzająpo cięciu lepkie końce 3’.

Wszystkie enzymy pozostawiają na końcu 5’ grupę fosforanową, a na końcu 3’ grupę hydroksylową.

Izoschizomery ** enzymy pochodzące z różnych szczepów, ale rozpoznające te same sekwencje; niekoniecznie muszą przecinać je w tych samych miejscach; jedne mogą pozostawiać lepkie końce, a inne tępe, np. Hpal, Hapll, Mspl, BsuF - rozpoznają-CCGG-

Tylko nieliczne enzymy rozpoznają i przecinają określone sekwencje w DNA jednoniciowym (HinPl). Warunki działania

-    aktywność niektórych restryktaz jest wrażliwa na metylację (metalacja powoduje hamowanie cięcia DNA przez pewne enzymy restrykcyjne, których sekwencja rozpoznawana jest identyczna in rozpoznawaną przez metylazę)

-    zależy od stężenia soli (NaCl - jonów chlorkowych) zawartej w buforze do trawienia

-    zależność od temperatury

Jednostka enzymu restrykcyjnego - ilość enzymu potrzebna do strawienia 1 pg DNA przez lh w zalecanym buforze i temperaturze, w objętości 20pl ( dotyczy to praktycznie DNA bakteriofaga X, w pozostałych przypadkach ilość enzymu musi być znacznie większa, zależnie od rodzaju DNA i często^ występowania rozpoznawanych miejsc).

2