Obraz4

r

Ćwiczenie 8

Chromatografia chelatująca (IMAĆ) - oczyszczanie rekombinowanego 6xHis-GFP na kolumnach Talon i IDA-Sepharose

1. Wstęp

Białka mają zdolność oddziaływania z jonami metali poprzez tworzenie wiązań jonowych lub koordynacyjnych. W przypadku tych ostatnich ma miejsce oddziaływanie jonu metalu z grupami funkcyjnymi, donorami elektronów (głównie resztą histydyny) i tworzenie wielokleszczowych kompleksów (chelatów). Już w latach siedemdziesiątych ubiegłego wieku Porath i wsp. wykorzystali tą właściwość białek do ich oczyszczania na nośnikach z immobilizowanymi jonami metali ( Cu²⁺, Zn²^ ). W zależności od zawartości oraz rozmieszczenia reszt histydynowych, różne białka wiązały się na nośniku z immobi--lizowanym metalem z różną siłą i mogły być mniej lub bardziej selektywnie wymyte z kolumny poprzez obniżanie pH eluentu lub zwiększanie stężenia imidazolu.

Ten typ chromatografii jest w pewnym sensie chromatografią powinowactwa lecz posiada własne określenie - chromatografia chelatująca lub IMAĆ (Immobilized Metal łon Affinity Chromatography). Pomimo, że tą metodą udało się oczyścić wiele białek, nigdy nie zyskała takiej popularności w odniesieniu do białek naturalnie występujących jak inne metody chromatograficzne. Metoda ta zyskała natomiast wielką popularność w przypadku oczyszczania białek rekombinowanych, które zmodyfikowano tak, że na N-lub C- końcu posiadały fuzyjny peptyd zawierający sekwencję oligohistydynową, 6xHis (ang. His-tag) lub jej modyfikacje. Sekwencja taka powoduje bardzo silne związanie się rekombinowanego białka z nośnikiem i łatwe odmycie wszystkich innych białek balastowych. Zaadsorbowane rekombinowane białko jest eluowane imidazolem o., wysokim stężeniu.

Do chromatografii IMAĆ w tym przypadku najczęściej 'wykorzystuje się jony niklu lub kobaltu skompleksowane przez ligandy takie jak kwasy : iminodioctowy (IDA), nitrylo-trioctowy (NTA) czy też karboksymetyloasparaginowy (TALON) - Rys. 1.

^CH,—C-g

l u_rsr -ch,-ch,-hj

IDA

d

C--0-

b    — Ot,—CH,—CU—Ni

NTA    l

i M J-& — CH,—Oł,——-

TALON

CH,—c—cn

II -o

fys. 1. Struktura drałujących ligmtdów i ich kompleksów z jonami metali (Me⁷*)

ł    kwas irninoiodowy (IDA)    i    |DA-Ni (II)

1l    kws mfrykifrioctmry (Ml)    e.    NTA-ffi (II)

c. kwas karhoksymetylo-l-asparaginowy (TALON)

1