Untitled 6

i/v

rośltnnychr-w-tym-do korwtici^oji mao genetycznyGhJ W praktyce, liczba polim

Licznych układów enzymatycznych w okreśtóńyfn materiale badawczym ; niewielka. Dodatkowym mankamentem jest konieczność dopracowywania, oi dla każdego enzymu, metodyki rozdziału, barwienia lub ekstrakcji.

8.2.1.2. Markery RFLP

Zasadniczy przełom w diagnostyce molekularnej nastąpił z chwilą opracows techniki analizy polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych DNA (RFLj^

Procedura prowadząca do ujawnienia tego typu polimorfizmu jest stosu złożona i pracochłonna (rys. 8.2.1). Pierwszy etap polega na izolacji genomoy DNA, który powinien być dobrze oczyszczony, bez uszkodzeń mechaniczn^^ i w odpowiedniej ilości. Każda analiza wymaga pobrania równej doścllj*™ z poszczególnych prób, trawienia jednym lub dwoma enzymami restrykcją i rozdziału na długim żelu agarozowym. Fragmenty rozdzielone przenoszone techniką Southema na Filtr nylonowy, na którym dochd hybrydyzacji z wyznakowaną radioaktywnie sondą molekularną, będącą naje, jednym z klonów biblioteki DNA badanego (sondy homologiczne) lub ]

(sondy heterologiczne) gatunku. Sonda hybrydyzuje z unikatową-?* komplementarną w jednym lub kilku loci, dając na autoradiogramie obrs lub kilku fragmentów DNA.    ilg*

Polimorfizm RFLP wynika głównie z mutacji obejmujących miejsca in ne, które doprowadziły do zróżnicowania odległości między nimi. Inną przyj zmienności może być niewielka delccja lub duplikacja, zmieniająca między najbliższymi miejscami restrykcyjnymi. Niewątpliwą zaletą markeri^J jest ich kodominacja, która zależy od zdolności sondy do wiązania się Z£Ćj| allelami w jednym locus. Do rzadkości należą przypadki dominowania, w któiychrgile różnią się sekwencją na tyle, że sonda hybrydyzuje tylko z jednym z nich. analiza RFLP jest zwykle poprzedzona testowaniem kilku enzymów restrykcyjni kątem ich przydatności w wykrywaniu polimorfizmu. Markery RFLP możliwość detekcji polimorfizmu w nieograniczonej liczbie odcinkój z rejonów kodujących i niekodujących, z zastosowaniem jednolitej badawczej. Właściwość ta zadecydowała o powszechnym użyciu markerów! konstrukcji map genetycznych większości roślin uprawnych.

Markery RFLP są szczególnie przydatne do analizy polimorfizmu I chondrialnego (mtDNA) i chloroplastowego (cpDNA), wykorzystywanej' filogenetycznych i taksonomicznych oraz do identyfikacji różnych form? matycznej męskiej sterylności. Duża liczba kopii cytoplazmatycznego DN/ że fragmenty restrykcyjne są widoczne w świetle UV, bezpośrednio po w żelu agarozowym, zawierającym bromek etydyny. Znakowanie sondy rydyzacja metodą Southema nie są w tym przypadku konieczne, jeśli bad^^^^Ą^j dotyczą specyficznych sekwencji.

Genomowy DNA różnych linii, po trawieniu enzymem restrykcyjnym

jjjndard wielkości ₎₍y_Zflakowany P

f ELEKTROFOREZA rozdział ze względu na długość fragmentów

Sr TRANSFER rozdzielonych r. Iregmentów DNA ^ _ ś : żelu na filtr

l

lut; nylonowy

- RĘCZNIKI -PAPIEROWE BIBUŁA 3mm

Podsiąkaniu roawoni NaOH, transit* kapilarny DMĄ z żelu na filii

BIBUŁA 3mm 'PODSTAWA

SONDA

DNA połączony z filtrem ,

Umieszczenie filtru w roztworzo z radioaktywną sondą

Odplukanie nie związanej sondy

WYWOŁANIE

AUTORADIOGRAMU

Umieszczenie filtru i filmu rentgenowskiego w kasecie, pomiędzy intensyfikującymi b ekranami (-70°C, 4-10 dni)

K sonda hybrydyzuje trwale tylko z sekwencją komplementarną

Rys. 8.2.1. Etapy analizy polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych (RFLP)