Untitled 6

roślinnych, w tym-do koniitrfawoji mu u gc nety c i¹11 y&hjw praktyce, liczba poLirnoi ficznych układów enzymatycznych w określonym materiale badawczym niewielka. Dodatkowym mankamentem jest konieczność dopracowywania, osobi* dla każdego enzymu, metodyki rozdziału, barwienia lub ekstrakcji.

ii i

8.2.1.2. Markery RFLP

Zasadniczy przełom w diagnostyce molekularnej nastąpił z chwilą opracowania techniki analizy polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych DNA (RFLP)f .ś Procedura prowadząca do ujawnienia tego typu polimorfizmu jest stosunkowi y-złożona i pracochłonna (rys. 8.2.1). Pierwszy etap polega na izolacji gcnomo\vega -DNA, który powinien być dobrze oczyszczony, bez uszkodzeń mechaniczny i w odpowiedniej ilości. Każda analiza wymaga pobrania równej ilości z poszczególnych prób, trawienia jednym lub dwoma enzymami restryj i rozdziału na długim żelu agarozowym. Fragmenty rozdzielone ną przenoszone techniką Southema na filtr nylonowy, na którym docj)] hybrydyzacji z wyznakowaną radioaktywnie sondą molekularną, będącąn jednym z klonów biblioteki DNA badanego (sondy homologiczne) lub (sondy heterologiczne) gatunku. Sonda hybrydyzuje z unikatową komplementarną w jednym lub kilku loci, dając na auloradiogramie obi lub kilku fragmentów DNA.    yg

Polimorfizm RFLP wynika głównie z mutacji obejmujących miejsca ne, które doprowadziły do zróżnicowania odległości między nimi. Inną zmienności może być niewielka dclccja lub duplikacja, zmieniająca .odległość między najbliższymi miejscami restrykcyjnymi. Niewątpliwą zaletą marker<|iy,jREt&' jest ich kodominacja, która zależy od zdolności sondy do wiązania sie-zjamMmgS allelami w jednym locus. Do rzadkości należą przypadki dominowania, w którypj®ftS’^ różnią się sekwencją na tyle, że sonda hybrydyzuje tylko z jednym z nich. analiza RFLP jest zwykle poprzedzona testowaniem kilku enzymów restrykeyjj kątem ich przydatności w wykrywaniu polimorfizmu. Markery RFLP możliwość detekcji polimorfizmu w nieograniczonej liczbie odcinki z rejonów kodujących i niekodujących, z zastosowaniem jednolitej badawczej. Właściwość ta zadecydowała o powszechnym użyciu markerów konstrukcji map genetycznych większości roślin uprawnych.

matycznej męskiej sterylności. Duża liczba kopii cytoplazmatycznego DNA<5PJ8$& że fragmenty restrykcyjne są widoczne w ś vietlc UV, bezpośrednio po rozdział'' w żelu agarozowym, zawierającym bromek etydyny. Znakowanie sondystp^/y: rydyzacja metodą Southema nie są w tym przypadku koniec :ne, jeśli badagjg£ę]£ dotyczą specyficznych sekwencji.

Markery RFLP są szczególnie przydatne do analizy polimorfizmu Di chondrialnego (mtDNA) i chloroplastowego (cpDNA), wykorzystywanej w filogenetycznych i taksonomicznych oraz do identyfikacji różnych form

Genomowy DNA różnych linii, po trawieniu enzymem restrykcyjnym n V\_    ____

Standard wielkości wyznakowany P

Y ELEKTROFOREZA rozdział ze względu na długość fragmentów

6 TRANSFER rozdzielonych Iregmemów DNA B- zielu na filtr f: nitroce ^{11 3z}°wy^s88fiM) A' Uj nylonowy

Podsiąkaniu roztwom NoOH. tranUcr kapilarny DNA z Zaiu rta filtr

BIBUŁA 3mm -PODSTAWA

SONDA

FILTR

DNA połączony z fltrem    .

Umieszczonie filtru w roztworzo z radioaktywną sondą

Odplukanie nie związanej sondy

WYWOŁANIE

AUTORADIOGRAMU

Umieszczenie filtru i filmu rentgenowskiego w kasecie, pomiędzy intensyfikującymi ^ ekranami (-70°C, 4-10 dni)

f.: sonda hybrydyzuje trwale tylko z sekwencją komplementarną

Rys. 8.2.1. Etapy analizy polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych (RFLP)