roślinnych, w tym-do koniitrfawoji mu u gc nety c i111 y&hjw praktyce, liczba poLirnoi ficznych układów enzymatycznych w określonym materiale badawczym niewielka. Dodatkowym mankamentem jest konieczność dopracowywania, osobi* dla każdego enzymu, metodyki rozdziału, barwienia lub ekstrakcji.
ii i
Zasadniczy przełom w diagnostyce molekularnej nastąpił z chwilą opracowania techniki analizy polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych DNA (RFLP)f .ś Procedura prowadząca do ujawnienia tego typu polimorfizmu jest stosunkowi y-złożona i pracochłonna (rys. 8.2.1). Pierwszy etap polega na izolacji gcnomo\vega -DNA, który powinien być dobrze oczyszczony, bez uszkodzeń mechaniczny i w odpowiedniej ilości. Każda analiza wymaga pobrania równej ilości z poszczególnych prób, trawienia jednym lub dwoma enzymami restryj i rozdziału na długim żelu agarozowym. Fragmenty rozdzielone ną przenoszone techniką Southema na filtr nylonowy, na którym docj)] hybrydyzacji z wyznakowaną radioaktywnie sondą molekularną, będącąn jednym z klonów biblioteki DNA badanego (sondy homologiczne) lub (sondy heterologiczne) gatunku. Sonda hybrydyzuje z unikatową komplementarną w jednym lub kilku loci, dając na auloradiogramie obi lub kilku fragmentów DNA. yg
Polimorfizm RFLP wynika głównie z mutacji obejmujących miejsca ne, które doprowadziły do zróżnicowania odległości między nimi. Inną zmienności może być niewielka dclccja lub duplikacja, zmieniająca .odległość między najbliższymi miejscami restrykcyjnymi. Niewątpliwą zaletą marker<|iy,jREt&' jest ich kodominacja, która zależy od zdolności sondy do wiązania sie-zjamMmgS allelami w jednym locus. Do rzadkości należą przypadki dominowania, w którypj®ftS’^ różnią się sekwencją na tyle, że sonda hybrydyzuje tylko z jednym z nich. analiza RFLP jest zwykle poprzedzona testowaniem kilku enzymów restrykeyjj kątem ich przydatności w wykrywaniu polimorfizmu. Markery RFLP możliwość detekcji polimorfizmu w nieograniczonej liczbie odcinki z rejonów kodujących i niekodujących, z zastosowaniem jednolitej badawczej. Właściwość ta zadecydowała o powszechnym użyciu markerów konstrukcji map genetycznych większości roślin uprawnych.
matycznej męskiej sterylności. Duża liczba kopii cytoplazmatycznego DNA<5PJ8$& że fragmenty restrykcyjne są widoczne w ś vietlc UV, bezpośrednio po rozdział'' w żelu agarozowym, zawierającym bromek etydyny. Znakowanie sondystp^/y: rydyzacja metodą Southema nie są w tym przypadku koniec :ne, jeśli badagjg£ę]£ dotyczą specyficznych sekwencji.
Markery RFLP są szczególnie przydatne do analizy polimorfizmu Di chondrialnego (mtDNA) i chloroplastowego (cpDNA), wykorzystywanej w filogenetycznych i taksonomicznych oraz do identyfikacji różnych form
Genomowy DNA różnych linii, po trawieniu enzymem restrykcyjnym n V\_ ____
Standard wielkości wyznakowany P
Y ELEKTROFOREZA rozdział ze względu na długość fragmentów
6 TRANSFER rozdzielonych Iregmemów DNA B- zielu na filtr f: nitroce 11 3z°wy^s88fiM) A' Uj nylonowy
Podsiąkaniu roztwom NoOH. tranUcr kapilarny DNA z Zaiu rta filtr
BIBUŁA 3mm -PODSTAWA
SONDA
FILTR
DNA połączony z fltrem .
Umieszczonie filtru w roztworzo z radioaktywną sondą
Odplukanie nie związanej sondy
WYWOŁANIE
AUTORADIOGRAMU
Umieszczenie filtru i filmu rentgenowskiego w kasecie, pomiędzy intensyfikującymi ^ ekranami (-70°C, 4-10 dni)
f.: sonda hybrydyzuje trwale tylko z sekwencją komplementarną
Rys. 8.2.1. Etapy analizy polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych (RFLP)