0000014 3

UWAGA: Przy nieco zmienionych parametrach metoda wirowania pozwala na frakcjonowanie składników komórki — por. np. stała sedymentacji podjednostek rybosomowych.

W CZASIE KOPIOWANIA DNA POWSTAJĄ WIDEŁKI REPUKACYJNE

Kolejnym krokiem w poznawaniu nośnika informacji genetycznej było wykazanie, że replikacja katalizowana jest enzymatycznie przez specjalny enzym „odczytujący" matrycę (dokonał tego Arthur Kornberg). Wkrótce potem okazało się, że odkryta przez Kornberga polimeraza DNA spełnia jedynie funkcje pomocnicze, m.in. uzupełnia brakujące fragmenty dwuniciowej helisy (por. dalej), a także naprawia uszkodzone DNA (por. ROZDZ: 8.2.2). Sama replikacja okazała się procesem znacznie bardziej złożonym, katalizowanym przez specyficzne kompleksy białek enzymatycznych (w ich skład wchodzą inne polimerazy DNA). Dalsze badania dowiodły natomiast, że ogólne zasady replikacji są takie same we wszystkich organizmach żywych (mówimy, iż są uniwersalne). Oczywiście istnieją różnice, szczególnie pomiędzy Pro- i Eucaryota. wynikające z nieco odmiennej organizacji materiału genetycznego, jednakże opiszę je później.

5'

Ryc II.

Ogólna zasada kopiowania DNA uwzględniająca model replikacji semikonsensatyw-nej (szkielet fosforanowo-cukrowy zacieniowano).

Skopiowanie dwuniciowej helisy DNA wymaga rozwiązania kilku problemów. Do najważniejszych można byłoby zaliczyć:

A)    odnalezienie miejsca początku procesu — miejsca inicjacji replikacji. Kopiowanie kwasu dcoksyrybonuklcinowcgo nie zaczyna się nigdy ad hoc, w dowolnym miejscu. Otóż w każdej cząsteczce DNA znajduje się jeden (albo więcej) specjalny odcinek, który cechuje się specyficzną sekwencją nukleotydów. Zwykle odcinek taki mierzy ok. 200—300 par nuklc-otydów i nazywamy go z angielska on gin (skrót: ori). Można powiedzieć, że sekwencja origin to coś w rodzaju zapisu: „tu zaczynać repłikację”.

B)    rozdzielenie obu nici bez zniszczenia ich struktury I-rzędowej. Kopiowanie wymaga rozdzielenia i rozplccenia nici matrycowych. Nic można dokonać tego w prosty sposób (podobnie jak nie da rady bez problemów spruć stary sweter zrobiony przez babcię na drutach), ponieważ powstają wówczas kłopoty ze skręcaniem się nici. U bakterii E. coli za tę

pierwszą czynność odpowiedzialne jest m.in. białko inicjatorowe DnaA, które wykorzystuje energię ATP do silnego zginania cząsteczki DNA. To zaś prowadzi do naprężania i rozrywania wiązań wodorowych w miejscu inicjacji. W takie otwarte miejsce wchodzi helikaza replikacyjna. czyli białko DnaB, które wypiera białko inicjatorowe i rozplata nici w obie strony (por. Ryc. 12 A i 12 B). Oddzielone, jednoniciowc fragmenty obu nici DNA stabilizowane są białkami zapobiegającymi odtwarzaniu struktury dwuniciowej. W ten sposób rozwiera się „oczko” rcplikacyjne i powstają widełki replikacyjne. Teraz „na teren budowy” wchodzi białko primazy syntetyzujące na obu niciach DNA krótkie, komplementarne odcinki starterowego RNA (tzw. primery). Dzieje się tak, ponieważ polimcrazy DNA potrafią jedynie dobudowywać dcoksynuklcotydy do już istniejących nici. Stąd kopiowanie każdego odcinka DNA zapoczątkowuje synteza krótkiego odcinka RNA (u E. coli liczącego ok. 10—12 nukleotydów). Utworzenie primerów kończy etap inicjacji replikacji.

O

9    O

Ryc. 12 A. Model replikacji w cząsteczce kolistej, np. u bakterii; O — ort gin.

Ze względu na ogromną złożoność informacji genetycznej u cukariontów (por. później ROZDZ: 3) problemy z jej badaniem są zdecydowanie większe. Dlatego poziom naszej wiedzy o inicjacji replikacji w tej grupie organizmów jest zdecydowanie mniejszy. Wiemy jednakże, iż ogólny mechanizm jest tu taki sam jak u bakterii (odnajdywanie miejsc inicjacji, włączanie białek inicjacyjnych. np. helikaz i primeraz oraz tworzenie widełek rcplikacyjnych). Oczywiście są też dość istotne różnice, jednak opisanie ich przekracza ramy tej książki (już i tak mam wyrzuty sumienia, ale... niewielkie).

Ryc. 12 B. Model replikacji h cząsteczce liniowej, np. u eukanontów: a — pojedyncze oczko replikacyjne, b — dwa oczka replikacyjne wynikające z obecności dwóch replikonów.

27